吳同壘，王洪彬，張志強，高桂生，史秋梅

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島 066604）

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖量占世界總量的65%，為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)做出了重大貢獻(xiàn)[1]。2005—2015年，中國的海水養(yǎng)殖面積年均增長率為3.61%，養(yǎng)殖總產(chǎn)量年均增長率為3.25%[2]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，規(guī)?；⒓s化程度加深，海水養(yǎng)殖的病害也逐年增加。其中由致病性弧菌引起的弧菌病一直是海水魚類及貝類養(yǎng)殖的“災(zāi)禍之源”[3,4]。近年來，相繼有大黃魚 Larimichthyscrocea、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides、青石斑魚Epinephelus awoara等養(yǎng)殖魚類及文蛤Meretrix meretrix L.、雜色鮑Haliotis diversicolor、方斑東風(fēng)螺Babylonia areolata等養(yǎng)殖軟體經(jīng)濟(jì)動物感染哈維氏弧菌Vibrio harveyi發(fā)病死亡，給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，尤其是亞洲、南美洲水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了養(yǎng)殖工作者的重視[5]。

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的耐藥現(xiàn)象極為普遍，給防控細(xì)菌性疾病帶來了極大的挑戰(zhàn)。疫苗能提高動物機(jī)體特異性免疫水平，且符合綠色、健康的養(yǎng)殖要求[6]，因此，研制新型疫苗是防控水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的重要方向。生物被膜指細(xì)菌在代謝過程中黏附在非生物或生物基質(zhì)的表面，由自身產(chǎn)生的胞外聚合物及基質(zhì)包裹，具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體，利于細(xì)菌抵抗外界不利因素[7]，具有分布廣及多重耐藥性、免疫逃避能力等特點。Karunasagar等[8]報道，哈維氏弧菌能在不同非生物基質(zhì)表面上形成生物被膜；Yatip等[9]研究了發(fā)酵豆制品納豆提取物對哈維氏弧菌生物被膜的抑制作用，而有關(guān)哈維氏弧菌生物被膜的其他方面研究較少。本試驗以致病性哈維氏弧菌QHD-1菌株為研究對象，測定初始菌液濃度、溫度、pH、鹽離子濃度等環(huán)境因素對QHD-1菌株生物被膜形成能力的影響，以了解不同理化條件下哈維氏弧菌生物被膜形成規(guī)律，為探索其致病機(jī)理及防治措施奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1分離菌株由從患病大菱鲆肝臟中分離得到，經(jīng)分離純化、鑒定及動物致病性試驗，證實其為致病性菌株?，F(xiàn)保存于本實驗室-80℃超低溫冰箱中。

主要試劑與儀器：胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）購自北京索萊寶生物科技有限公司；結(jié)晶紫購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250購自天津市百世化工有限公司；96孔聚苯乙烯板購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；酶標(biāo)儀購自Microplate Autoreader EL311；超低溫冰箱購自澳柯瑪股份有限責(zé)任公司；其他與本試驗相關(guān)的試劑與儀器均由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化及菌懸液的配制

從-80℃超低溫冰箱中，取出哈維氏弧菌QHD-1甘油凍存菌株，于TSA培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)；挑取單菌落接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%NaCl的TSB 培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng) 10h，6 000r/min 離心15min，收集菌體，用無菌生理鹽水清洗3次，收集細(xì)菌細(xì)胞，最后用無菌生理鹽水稀釋至終濃度為1×108cfu/mL。

1.2.2 理化因子對QHD-1生長的影響

生長曲線的測定：在50mL TSB培養(yǎng)液中加入適量體積對數(shù)期的哈維氏弧菌QHD-1菌液，于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)。每隔1h取樣一次，以O(shè)D590為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

鹽離子濃度：分別配制0%～8%NaCl的TSB培養(yǎng)液，加入適量對數(shù)期哈維氏弧菌QHD-1菌液，于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)12 h后，取樣，測定菌液OD590。以O(shè)D590為縱坐標(biāo)，鹽離子為橫坐標(biāo)繪圖。比較鹽離子濃度對哈維氏弧菌QHD-1生長的影響。

溫度：將培養(yǎng)溫度分別設(shè)為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，方法同 1.2.2，比較溫度對QHD-1生長的影響。

pH：用NaOH和HCl調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基pH，分別為1～10（間隔1個單位），方法同1.2.2。比較pH對哈維氏弧菌QHD-1生長的影響。

NH4+濃度：分別在培養(yǎng)基中添加（NH4）2SO4，使含量分別為0%～2.0%，方法同1.2.2。比較NH4+對QHD-1生長的影響。

Mg2+濃度：分別在培養(yǎng)基中添加MgSO4，使其含量分別0%～8%，方法同1.2.2。比較Mg2+對QHD-1生長的影響。

1.2.3 生物被膜的形成與測定

哈維氏弧菌生物被膜的形成與定量測定參考文獻(xiàn)[10]中報道的方法進(jìn)行，并略加改動。在96孔聚苯乙烯板每孔中加入TSB培養(yǎng)液150μL，加入菌液（濃度1×108cfu/mL）50 μL；將96孔聚苯乙烯板置于濕盒中，30℃中孵育16h；每組做5個平行孔，以TSB培養(yǎng)基為空白對照；吸出孔內(nèi)菌液，生理鹽水沖洗3次，去除游離細(xì)菌；將聚苯乙烯孔板干燥固定30min。每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫200μL，常溫下放置10min后吸出染液；用生理鹽水洗板孔3次，干燥；于每孔中加入體積分?jǐn)?shù)為33%的乙酸200μL，溶解結(jié)晶紫，利用酶標(biāo)儀測定OD590。

1.2.4 初始菌液濃度對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

將QHD-1濃度調(diào)至1.0×109cfu/mL，依次倍比稀釋，得到菌懸液濃度為1.0×108～1.0×102cfu/mL，培養(yǎng)方法同1.2.2。

將孵育溫度設(shè)定為 4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH 為 2～10，NaCl濃度為0%～9%，培養(yǎng)方法同1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株QHD-1生長曲線

由圖1可知，在30℃時，該菌很快進(jìn)入快速生長階段，從第1h到8h為對數(shù)生長期，而后在一段時間內(nèi)維持在較高水平，即穩(wěn)定期，從第9h后進(jìn)入衰退期。

圖1 V.harveyi QHD-1生長曲線Fig.1 Growth curve of V.harveyi QHD-1

2.2 不同理化因子對QHD-1生長的影響

2.2.1 鹽離子濃度對QHD-1生長的影響

由圖2可知，鹽離子濃度為0%～6%時，菌株的生長速度不同：鹽離子濃度在1%～7%之間時，培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液達(dá)到較高的濃度，尤以3%鹽離子濃度時，QHD-1生長最快；鹽離子濃度在7%～8%之間時，QHD-1濃度較低，而鹽離子濃度為8%時，菌株QHD-1只有少量生長。這說明鹽離子濃度不同對菌株QHD-1生長的影響不同。

圖2 鹽離子濃度對V.harveyi QHD-1生長的影響Fig.2 Effect of salt ion concentration on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.2 溫度對QHD-1生長的影響

由圖3可知，哈維氏弧菌QHD-1在15～35℃范圍內(nèi)，生長良好；在25℃、30℃和35℃中培養(yǎng)12h后，菌液濃度較高，但差異不顯著；溫度為10℃培養(yǎng)12h，菌株QHD-1生長較緩，在4℃下培養(yǎng)12h，菌株QHD-1不生長。這說明溫度影響哈維氏弧菌菌株QHD-1的生長。

圖3 溫度對V.harveyi QHD-1生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.3 pH對QHD-1生長的影響

由圖4可知，不同pH對哈維氏弧菌QHD-1的生長影響差異較明顯。當(dāng)pH在6～9之間時，菌株生長良好；在pH＜4或pH＞10時，菌株生長較緩，甚至不生長。

圖4 pH對V.harveyi QHD-1生長的影響Fig.4 Effect of pH value on the growth of V.harveyi QHD-1

2.2.4 NH4+對QHD-1生長的影響

結(jié)果顯示，不同NH4+含量對QHD-1生長的影響不同。當(dāng) TSB培養(yǎng)基中添加（NH4）2SO4時，NH4+促進(jìn)了菌株QHD-1的生長；當(dāng)（NH4）2SO4含量為0.05%時，促生長作用最佳。這說明NH4+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長。

2.2.5 Mg2+對QHD-1生長的影響

結(jié)果顯示，不同Mg2+含量對菌株QHD-1生長的影響不同。當(dāng)Mg2+含量在0%～8%之間時，均能促進(jìn)菌株QHD-1的生長，尤其是Mg2+含量為1%時，對菌株QHD-1促生長作用最明顯。這說明Mg2+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長。

2.3 培養(yǎng)條件對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的影響

2.3.1 初始菌液濃度對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

由圖5可知，菌液濃度為1.0×102～1.0×109cfu/mL時，生物被膜形成量逐漸升高；當(dāng)菌液濃度＜1.0×107cfu/mL時，生物被膜形成量少；初始菌液濃度低于該濃度時，生物被膜的形成量之間無顯著差異；當(dāng)初始菌濃度達(dá)到1.0×108cfu/mL～1.0×109cfu/mL時，細(xì)菌生物被膜成膜量顯著增加，與其他初始菌濃度下的生物被膜形成量差異極顯著（P＜0.01）。這說明初始菌液濃度影響菌株生物被膜的形成。

2.3.2 不同溫度對哈維氏弧菌成膜的影響

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度在4～20℃之間時，菌株QHD-1生物被膜形成量較低；當(dāng)培養(yǎng)溫度在25～35℃之間時，菌株生物被膜形成量較高，且維持較高水平；30℃時，菌株QHD-1生物被膜形成量達(dá)峰值，與其他溫度下菌株生物被膜形成量差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)溫度為40℃時，生物被膜形成量較低。

圖5 初始菌液濃度對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.5 Effect of initial bacterial concentration on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

圖6 培養(yǎng)溫度對哈維氏弧菌成膜形成的影響Fig.6 Effect of incubation temperature on the film formation of V.harveyi QHD-1

2.3.3 pH對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

由圖7可知，當(dāng)pH為7～8時，菌株QHD-1生物被膜形成量最大，與其他組差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)pH＜4時，菌株QHD-1生物被膜的形成量較低；而當(dāng)pH升高到5～9時，則逐漸升高，pH為8時，形成量最大。這說明pH影響菌株QHD-1生物被膜的形成。

圖7 pH對V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.7 Effect of pH value on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

2.3.4 鹽離子濃度對哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

由圖8可知，當(dāng)NaCl含量在1%～5%時，該菌生物被膜形成量逐漸增加，且NaCl濃度在5%時，生物被膜形成量最大，與其他NaCl含量生物被膜的形成量差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)NaCl含量＞5%時，菌株QHD-1生物被膜形成量下降；NaCl含量在0%和8%時，菌株QHD-1幾乎不形成生物被膜。

圖8 鹽離子濃度對V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.8 Effect of salt ion concentration on the formation of V.harveyi QHD-1 biofilm

3 討論

引起魚類疾病的原因有很多，主要包括環(huán)境、傳染性病原等，如病毒、寄生蟲、細(xì)菌等[11]。一些致病性弧菌引起的細(xì)菌病在水產(chǎn)養(yǎng)殖中頻發(fā)，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

生物被膜形成能力是細(xì)菌致病性和耐藥性強弱的重要影響因素。生物被膜的形成是個動態(tài)過程，不同階段生化特性不同，且受多種因素的影響[12,13]。本試驗結(jié)果顯示，哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1能形成生物被膜，且受多種因素的影響，其中與起始菌液濃度關(guān)系最密切。當(dāng)菌液濃度在1.0×102～1.0×107cfu/mL時，對該菌生物被膜的形成量影響不大，原因可能與游離菌密度較低時，細(xì)菌初期黏附在聚苯乙烯板上的細(xì)菌量少有關(guān)；當(dāng)菌液濃度為1.0×108～1.0×109cfu/mL時，生物被膜形成量較大，與李海平等[14]研究結(jié)果一致。陳強等[15]的研究結(jié)果也表明細(xì)菌的粘附量與菌液濃度關(guān)系密切，且呈正比關(guān)系。因此，可認(rèn)為細(xì)菌黏附促進(jìn)了其生物被膜的形成，而細(xì)菌的黏附量會隨著菌液濃度的升高而增加。細(xì)菌起始濃度高有利于生物被膜的形成，溫度也影響細(xì)菌生物被膜的形成。本研究中，在 4℃、10℃、40℃時，菌株 V.harveyi QHD-1 生物被膜形成量較少，25～35℃之間是形成生物被膜的最適溫度，與菌株V.harveyi QHD-1的最適生長溫度接近，這表明哈維氏弧菌在活力最好時形成生物被膜最強。本試驗結(jié)果顯示，pH為2～10時，哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1菌株均能形成生物膜，而pH8時，形成的生物膜量最大，這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。滲透壓顯著影響生物被膜的形成。本實驗結(jié)果顯示，哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～8%時，均可形成生物被膜；當(dāng)NaCl含量在0時，幾乎不能形成生物被膜，這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。鄢慶枇等[16]、尹清干等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度為0時，細(xì)菌形成生物被膜的效果很差，可能與細(xì)菌在介質(zhì)上粘附量有關(guān)。黏附是細(xì)菌成膜的第一步，無法黏附在基質(zhì)上就難以形成生物被膜；當(dāng)NaCl濃度過高時，抑制細(xì)菌形成生物被膜的原因可能是細(xì)菌受到環(huán)境生存壓力較大，影響了細(xì)菌的生長。

綜上所述，哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1形成生物膜與外界環(huán)境因子變化關(guān)系密切，而初始菌液濃度、溫度、pH、鹽度等各種環(huán)境因子均能顯著影響哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的形成。