紀(jì)仁平 李煥軍 馮艷微 張榮良 王衛(wèi)軍① 楊建敏①

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306;2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺 264006)

長牡蠣(Crassostrea gigas),地方名蠔、蠣黃、海蠣子、蚵等,屬于珍珠貝目、牡蠣科、巨蠣屬。長牡蠣自然分布于西太平洋海域,是一種廣溫、廣鹽性貝類。牡蠣因其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),生長快速,而成為我國乃至全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的一種經(jīng)濟(jì)貝類。近幾年長牡蠣的養(yǎng)殖規(guī)模越來越大,產(chǎn)量也大幅度提高,但其種質(zhì)卻出現(xiàn)明顯的退化。因此,良種選育是我國長牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題,而微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)可為長牡蠣群體遺傳多樣性分析和家系親權(quán)鑒定等方面的研究提供技術(shù)支持。

在水產(chǎn)動物研究領(lǐng)域,微衛(wèi)星標(biāo)記因其具有高多態(tài)性,共顯性遺傳等特點(diǎn),已在分子標(biāo)記輔助育種和家系分析等方面得到廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)80年代,Chamberlain等(1988)首次嘗試了多重PCR反應(yīng)模式,即在同一 PCR反應(yīng)體系中加入多對微衛(wèi)星引物,同時進(jìn)行多個目標(biāo)序列的擴(kuò)增分析。多重 PCR技術(shù)具有省時高效、高通量、低成本等優(yōu)點(diǎn),且可有效減少靶基因片段的假陽性現(xiàn)象,檢驗(yàn)效率得到明顯提高(羅偉等,2013)。因此,微衛(wèi)星多重PCR為水生生物親權(quán)關(guān)系分析(Lerceteau-K?hler et al,2006)、種質(zhì)鑒定(王婷等,2013)、群體遺傳分析(Li et al,2007)、遺傳分離模式分析(聶鴻濤等,2013)等研究提供了有力的工具。目前關(guān)于長牡蠣微衛(wèi)星多重PCR已有報道,但一般都是三重或四重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系(Li et al,2010;Taris et al,2005)。本研究從已報道的長牡蠣微衛(wèi)星中開發(fā)出了兩組微衛(wèi)星五重 PCR反應(yīng)體系,并在2012年構(gòu)建的0527組和0612組的各27個全同胞家系的親權(quán)鑒定中得以應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 家系樣品的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)家系材料的構(gòu)建于2012年5月27日(記為0527組)和6月12日(記為0612組)在山東省煙臺海 益 苗 業(yè) 有 限 公 司 萊 州 育 苗 場 (LZ,37°26′1″N,120°02′15″E)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用親貝為經(jīng)過四代選育的中日韓三個群體。每個群體分別選取3個父本和3個母本個體作為親貝,0527組和0612組都采用表1所示的部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方式分別建立27個全同胞家系;當(dāng)各家系發(fā)育至D形幼蟲期時,計(jì)密度并將各家系幼蟲等量混合,然后進(jìn)行混合培育。取 0527組和0612組各18個親本的閉殼肌保存于70%乙醇中用于DNA的提取。

表1 27個長牡蠣全同胞家系的構(gòu)建Tab.1 The construction for 27 full-sib families of the Pacific oyster

1.2 樣品采集及DNA提取

當(dāng)養(yǎng)成至560日齡時,對兩個實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行取樣。隨機(jī)選取0527組653個子代和0612組382個子代個體的閉殼肌保存于 70%乙醇中用于提取 DNA。各實(shí)驗(yàn)組子代和親本基因組DNA的提取按照Li等(2002)氯仿/異戊醇法,通過分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠檢測 DNA樣品的濃度和純度,并將 DNA濃度調(diào)至30ng/μL,–20°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 長牡蠣微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

從已開發(fā)的長牡蠣微衛(wèi)星中,根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性、序列重復(fù)單位、連鎖信息,以及擴(kuò)增效果等篩選出 43個位點(diǎn)(Li et al,2003;Sauvage et al,2009)。微衛(wèi)星引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。每個位點(diǎn)最佳PCR擴(kuò)增條件用10個個體檢測。以引物的多態(tài)性,條帶大小及清晰程度,擴(kuò)增效率等作為篩選條件,挑選出擴(kuò)增效果最好的 10個微衛(wèi)星位點(diǎn)用于多重PCR的開發(fā),ucdCg149,ucdCg109,ucdCg140,ucdCg181,ucdCg170,ucdCg112,ucdCg129,ucdCg134,ucdCg162,ucdCg151 (Li et al,2003)和CGSILI39 (Sauvage et al,2009)(表2)。將10個位點(diǎn)分為兩組,每組中用四種顏色的熒光標(biāo)記(HEX,FAM,ROX和TAMRA),構(gòu)成兩組微衛(wèi)星五重PCR反應(yīng)體系(Multiplex Set 1,MS 1;Multiplex Set 2,MS 2)。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與高度去離子甲酰胺(HIDI)和分子量內(nèi)標(biāo)GeneScan ROX500/ LIZ500 (美國ABI公司)以產(chǎn)品說明中要求的比例進(jìn)行混合,變性 5min后迅速冷卻,于3730 XL測序列分析儀(美國ABI公司)上進(jìn)行檢測分析。用 Genemapper v.3.7軟件(美國Applied Biosystems公司)分析DNA片段大小。

1.5 微衛(wèi)星標(biāo)記優(yōu)化組合

根據(jù)適于同時擴(kuò)增的位點(diǎn)最大化且同一熒光標(biāo)記的位點(diǎn)間等位基因不重疊的原則(Li et al,2010)將這些位點(diǎn)進(jìn)行五重 PCR組合。通過對退火溫度、反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)(退火溫度,延伸時間)等條件進(jìn)行優(yōu)化,確定五重PCR的最佳反應(yīng)條件。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

首先運(yùn)行CERVUS 3.0 (Kalinowski et al,2007)軟件中的模擬功能估算兩組長牡蠣家系鑒定所需要的位點(diǎn)數(shù)及其鑒定效率。軟件操作具體參數(shù)設(shè)置如下:模擬子代數(shù)目設(shè)置為10000 (循環(huán)重復(fù)數(shù)),父母本數(shù)根據(jù)軟件要求均為實(shí)際父母本數(shù)設(shè)為 9,親本檢測率設(shè)置為 100%,位點(diǎn)檢測率為 100%,分型誤差率為1%,置信區(qū)間設(shè)置為95%,親本性別已知。家系鑒定運(yùn)用CERVUS 3.0中基于似然性的計(jì)算方法從非排除親本中選擇最可能的親本。

同時也采用CERVUS 3.0對各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Number of alleles,Na),多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)和位點(diǎn)的非排除能力(NE-1P,NE-2P,NE-PP)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。親本對子代的貢獻(xiàn)差異由SPSS 14.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行非參數(shù)卡方檢驗(yàn)。

表2 用于多重PCR體系構(gòu)建的微衛(wèi)星位點(diǎn)的基本信息Tab.2 Information of the SSR loci for establishment of multiplex PCR system

2 結(jié)果

2.1 五重PCR的優(yōu)化

設(shè)計(jì)的引物組合經(jīng)過篩選優(yōu)化后獲得了兩組微衛(wèi)星五重PCR體系。

兩組五重 PCR反應(yīng)體系 25μL包括: 模板 DNA 1.0μL (30ng),10×PCR Buffer 2.5μL,25mmol/L MgCl22.0μL,10mmol/L dNTPs 0.5μL,10mmol/L引物每對各0.2μL,5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.2μL,純水 17.8μL。

兩組五重 PCR反應(yīng)程序均為: 95°C預(yù)變性3min;95°C變性 30s,退火溫度 60°C 30s,72°C延伸30s,循環(huán) 10次;95°C變性 30s,退火溫度 55°C 30s,72°C延伸 30s,循環(huán) 20次;最后 72°C 延伸 6min;4°C 保存。

各體系的引物組合、引物濃度詳見表3、表4。部分微衛(wèi)星五重PCR的毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖1。

圖1 微衛(wèi)星五重PCR的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.1 The capillary electrophoresis amplified by SSR 5-multiplex PCR

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 0527實(shí)驗(yàn)組 10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)范圍從19到36,平均值為28.8,位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量為 0.8924,反映了這兩組五重 PCR在家系鑒定中具有較高的排除能力。兩組五重 PCR的觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)范圍為 0.426—0.811,平均觀測雜合度為 0.6519,期望雜合度(Expected heterozygosity,He)范圍為 0.870—0.931,平均期望雜合度為 0.9011,無效等位基因頻率為5.9%—36.3% (表 3)。

表3 0527組長牡蠣中兩組微衛(wèi)星五重PCR的特征Tab.3 Characteristics of two SSR 5-multiplex PCRs in the Pacific oyster of group 0527

2.2.2 0612實(shí)驗(yàn)組 經(jīng)篩選后得到10個微衛(wèi)星位點(diǎn)(表4)。每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)為15—31,平均值為 23.7;觀測雜合度(Ho)為 0.376—0.845,平均觀測雜合度為 0.5588;期望雜合度(He)為 0.712—0.933,平均期望雜合度為0.8652;位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量為0.8516;無效等位基因頻率為7.7%—41.4%。

表4 0612組長牡蠣中兩組微衛(wèi)星五重PCR的特征Tab.4 Characteristics of two SSR 5-multiplex PCRs of group 0612 in the Pacific oyster

2.3 微衛(wèi)星五重PCR在家系鑒定中的應(yīng)用

2.3.1 0527實(shí)驗(yàn)組 使用兩組微衛(wèi)星五重PCR對27個家系的 653個個體進(jìn)行了親子鑒定,經(jīng)用CERVUS 3.0軟件進(jìn)行分析,使用這兩組微衛(wèi)星五重PCR的親子鑒定成功率為100%;只用MS 1,可以將96%的子代鑒定到親本;只用第二組 MS 2,可以將97%的子代鑒定到親本。

對653個長牡蠣子代個體進(jìn)行基因分型,將其全部成功分配至唯一親本對,子代在 27個全同胞家系中的分布情況見表 5。家系間子代數(shù)目差異非常大,家系F23 (♀8×♂8)有72個子代,占子代總數(shù)的11.0%;而家系 F04 (♀2×♂2)僅有 1個子代,占子代總數(shù)的0.2%。通過卡方檢驗(yàn)可知,父本(χ2=148.02,P=0.00)和母本(χ2=208.55,P=0.00)對子代的貢獻(xiàn)率有顯著性差異: 母本產(chǎn)生的子代數(shù)最多為 137個(♀8),貢獻(xiàn)率為21.0%;最少的為7個(♀2),貢獻(xiàn)率為1.1%。父本產(chǎn)生的子代數(shù)最多的為117個(♂9),貢獻(xiàn)率為17.9%;最少為27個(♂2),貢獻(xiàn)率為4.1%(表5)。

2.3.2 0612實(shí)驗(yàn)組 使用兩組微衛(wèi)星五重PCR對0612組27個全同胞家系382個個體進(jìn)行親子鑒定的準(zhǔn)確率為100%;只用MS 1,親子鑒定準(zhǔn)確率為96%;只用MS 2,可以將95%的子代鑒定到親本。

表6為0612組382個長牡蠣子代個體在27個全同胞家系中的分布情況。子代在建立的 27個家系中呈現(xiàn)不均等分布。不同家系間的子代數(shù)有較大差異,從 1 (F27,♀9×♂9)到 68 (F25,♀9×♂1)不等?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示,母本(χ2=119.86,P=0.00)和父本(χ2=142.88,P=0.00)對子代的貢獻(xiàn)率有顯著性差異: 母本產(chǎn)生的子代數(shù)最多和最少分別為80 (♀9)和9 (♀3),貢獻(xiàn)率分別為 20.9%和 2.4%;父本產(chǎn)生的子代數(shù)最多和最少分別為93 (♂1)和14 (♂9),貢獻(xiàn)率分別為24.3%和3.7%。

表5 0527組中27個長牡蠣全同胞家系的653個個體的親權(quán)分析Tab.5 Parentage assignment of 653 offspring from 27 full-sib families of group 0527 in the Pacific oyster

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR無效等位基因

微衛(wèi)星中位點(diǎn)的突變、插入或缺失是無效等位基因產(chǎn)生的主要原因(Callen et al,1993;Pemberton et al,1995)。無效等位基因的出現(xiàn)是降低家系分析準(zhǔn)確率的主要來源之一(Marshall et al,1998),但并不影響其在家系分析研究中的應(yīng)用(Li et al,2005)。通過增加微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)和避免使用無效等位基因頻率過高的微衛(wèi)星位點(diǎn)可提高微衛(wèi)星位點(diǎn)的家系鑒定能力(Carlsson,2008;Wang et al,2010)。McGoldrick等(2000)曾報道太平洋牡蠣中無效等位基因頻率為20%。Li等(2003)發(fā)現(xiàn)長牡蠣中 51.9%的微衛(wèi)星位點(diǎn)含有無效等位基因。Hubert等(2004)也報道了在長牡蠣中無效等位基因較高,達(dá)51.0%。本實(shí)驗(yàn)的10個微衛(wèi)星位點(diǎn)在0527組的27個全同胞家系鑒定中的無效等位基因頻率為5.9%—36.3%,而在0612組的27個全同胞家系鑒定中無效等位基因頻率為 7.7%—41.4%。

表6 0612組中27個長牡蠣全同胞家系的382個個體的親權(quán)分析Tab.6 The parentage assignment of 382 offspring from 27 full-sib families of group 0612 in Pacific oyster

3.2 微衛(wèi)星多重PCR在家系鑒定中的應(yīng)用

微衛(wèi)星多重 PCR技術(shù)已應(yīng)用于多種水生動物的家系鑒定分析。聶鴻濤等(2013)用12個微衛(wèi)星位點(diǎn)對12個皺紋盤鮑全同胞家系的 372個子代進(jìn)行家系鑒定,兩組多態(tài)信息含量最高的多重 PCR的鑒定成功率分別為90%和86%,在此基礎(chǔ)上增加任意一個多重PCR組合,即可達(dá)到 100%的鑒定成功率。李佳凱等(2014)建立了大黃魚微衛(wèi)星多重PCR體系,使用3組微衛(wèi)星多重PCR體系進(jìn)行親子鑒定準(zhǔn)確率為100%。苗貴東等(2011)對大菱鲆7個人工選育家系進(jìn)行了親子鑒定,已知1個親本時兩組多重PCR的鑒定成功率為 96.42%,在雙親未知的情況下親子鑒定準(zhǔn)確率為96.58%。Li等(2010)使用兩組多態(tài)信息含量最高的微衛(wèi)星多重PCR對12個單對交配長牡蠣家系進(jìn)行基因分析,達(dá)到100%的鑒定成功率。

在本試驗(yàn)中,用兩組微衛(wèi)星五重 PCR鑒別時,在0527組和0612組的鑒定成功率均為100%;只用MS 1,可以將0527組96%的子代和0612組96%的子代鑒定到親本;只用MS 2,可以將0527組97%的子代和0612組95%的子代鑒定到親本。本研究中較高的家系鑒定成功率可能與所使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)較好及其多態(tài)性水平較高有關(guān),這與 Gheyas等(2009)所提到的選擇更多信息量大、多態(tài)性高的位點(diǎn)是達(dá)到高鑒定率的必要保障的觀點(diǎn)相一致。

作者僅用兩組微衛(wèi)星五重 PCR反應(yīng)體系就完成了 10個微衛(wèi)星位點(diǎn)的分型,在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)長牡蠣群體的遺傳多樣性分析,充分體現(xiàn)了多重 PCR快速高效、高通量、節(jié)約、簡便的特點(diǎn)。本研究中篩選出的微衛(wèi)星多重 PCR體系不僅可以應(yīng)用于長牡蠣群體的親子鑒定分析以及分子標(biāo)記輔助育種,還可為家系群體遺傳多樣性分析和遺傳關(guān)系研究等方面的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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