伍 琴 唐建洲 劉 臻 ① 趙玉蓉 郝 光 魯雙慶

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 長沙 410128;2.湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 常德 415000;3.長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系 長沙 410003)

?；撬?2-氨基乙烷磺酸)是一種能在魚體內(nèi)自主合成的含硫非蛋白氨基酸。對魚體內(nèi)的營養(yǎng)生理具有很大作用,如影響動(dòng)物視力和神經(jīng)系統(tǒng),調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓,促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高魚的生長性能等。越來越多的研究者把?；撬崽砑拥斤暳现?探討?；撬釋Φ~和海水魚養(yǎng)殖的生理、代謝、及營養(yǎng)的影響(Li et al,2009;El-Sayed et al,2013)。?；撬嵩隰~體內(nèi)可以通過游離氨基酸的代謝自身合成,但是多數(shù)魚類尤其是淡水魚類自身合成的?；撬釢舛群艿?不能滿足自身生長需求,必須通過飲食來補(bǔ)充。已有研究表明,在飼料中添加?；撬崮芴岣呶鍡l鰤的繁殖能力(Matsunari et al,2006);在魚飼料中添加牛磺酸能提高飼料利用率和魚的生產(chǎn)性能(Takagi et al,2006a,2006b,2010,2011;Yamamoto et al,2000)。添加適量牛磺酸的飼料提高了黃河鯉魚的胰腸蛋白酶活性(高春生等,2007)。但是有關(guān)牛磺酸影響鯽魚生長性能、腸道細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)消化吸收的機(jī)理研究尚未見報(bào)道,因此本試驗(yàn)旨在飼料中添加不同劑量的牛磺酸,研究?；撬釋a魚生長性能,腸道黏膜形態(tài),以及蛋白消化吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期能為牛磺酸應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)以及?；撬釋λa(chǎn)動(dòng)物的作用機(jī)理提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

配制6種等氮等能飼料,飼料蛋白源主要是豆粕和魚粉,飼料脂肪源主要是豆油和魚油,飼料糖源則主要由面粉和淀粉提供。參考文獻(xiàn)(Matsunari et al,2006;Xie et al,2014),在鯽魚基礎(chǔ)飼糧中添加牛磺酸的劑量分別為 0.0、1.0、2.5、4.0、6.0以及 9.0g/kg (?；撬嵊缮虾Ｃ髫S生物科技有限公司提供,分析純)。飼糧原料粉碎后用 40目篩篩凈雜質(zhì),飼料原料混勻采用的是由小比重成分到大比重成分逐級擴(kuò)大的方法,制粒前把魚油等脂肪源與水預(yù)混合再加到混合好的原料中充分混勻,用 SLX-80型軟顆粒飼料機(jī)加工成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料。分析飼料成品得知各組飼糧中牛磺酸的準(zhǔn)確含量分別為 2.1、2.99、4.4、5.7、7.5、10.1 g/kg,基礎(chǔ)飼料配方如表1所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成(%)及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal fodder

1.2 試驗(yàn)用魚的養(yǎng)殖管理

選取同批孵化、體質(zhì)健壯的鯽魚(由湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所提供),初始體重為(29.07±0.19)g,飼喂周期為8周。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理組,每個(gè)處理組分為4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)有魚20尾。養(yǎng)殖試驗(yàn)于2014年7—9月在長沙學(xué)院產(chǎn)學(xué)研基地室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行,養(yǎng)殖用缸規(guī)格為120cm×80cm×80cm。試驗(yàn)開始后,每日定點(diǎn)定時(shí)投喂3次,均為飽食投喂,飼喂期間養(yǎng)殖缸每天不斷增氧,水溫控制在 24—27°C,pH 控制在6.5—7.5。每天測量水溫、記錄投喂量和觀察攝食情況。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 生產(chǎn)性能指標(biāo) 8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束,停食24h后采樣,分別稱取每缸魚體重并記錄尾數(shù),算出每缸魚的平均體重、增重率(weight gain rate,WGR)、特定生長率(special growth rate,SGR)、飼料系數(shù)(feed coefficient,FC)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)。計(jì)算公式如下:

增重率(WGR,%)= (末均重－初均重)/初均重×100%;

特定生長率(SGR,%/d)= (ln末均重－ln初均重)/實(shí)驗(yàn)天數(shù)×100%;

飼料系數(shù)(FC)= 總攝食量/(末總重－初總重);

蛋白質(zhì)效率(PER)= (末均重－初均重)/(尾均攝食日糧總量×飼糧粗蛋白含量)。

1.3.2 血清生化指標(biāo) 試驗(yàn)結(jié)束后,從每缸魚中隨機(jī)撈選 3尾魚進(jìn)行尾靜脈采血,迅速摘下針頭并將血液注入已滅菌的1.5mL EP管中,4°C靜置直至析出大量血清,4000 r/min離心10 min,取血清保存在–80°C待測。血清中 T3、T4、尿素氮、葡萄糖等血清生化指標(biāo)由中國人民解放軍第163醫(yī)院檢測得到。

1.3.3 腸道黏膜形態(tài)測定 養(yǎng)殖結(jié)束后,每缸隨機(jī)撈取魚3尾,解剖后分離腸道,用0.1 mol/L PBS溶液輕輕沖洗腸道,用 4%多聚甲醛溶液固定中腸,按照石蠟切片的制作程序(脫水、石蠟包埋、切片和H-E染色)制出切片,在 10×10顯微鏡下觀察并拍照。每張切片隨機(jī)選10—20根平整完好的的絨毛,用軟件Image-pro plus6.0測量其高度及相鄰的隱窩深度[測量方法參考孫浪(2013)],算出絨毛高度與隱窩深度的比值,最后把各指標(biāo)的平均數(shù)作為測定數(shù)值。

1.3.4 腸道蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因相對表達(dá)的測定 養(yǎng)殖結(jié)束后,每缸魚隨機(jī)取3尾,在無菌環(huán)境下于冰盒上解剖后分離出腸道,用剪刀剪碎裝入無RNAse EP管中,迅速投入液氮中保存,用于基因表達(dá)的分析,全程低溫操作。

1.3.5 熒光定量引物設(shè)計(jì) 用Tritrol試劑(TaKaRa)提取鯽魚腸道樣品中總 RNA,隨后用 PrimeScript RT reagentKit (Perfect Real Time)(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA。從GenBank中查詢并下載鯽魚的氨肽酶N (Aminopeptidase,APN)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Peptide Transporter,PepT1)、基因系尾型同源盒基因(caudal homeobox genes,CDX2)、L-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白(L-transport carrier protein amino acids,LAT2)基因序列全長,找到ORF區(qū),實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)特異引物用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì),內(nèi)參基因引物根據(jù)鯽魚管家基因β-actin設(shè)計(jì)(見表2)。

表2 熒光定量分析的目的基因與內(nèi)參基因的引物參數(shù)Tab.2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

Real-time PCR擴(kuò)增采用SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)和 BIO-RAD CFX96TMReal-time PCR儀進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。 PCR 反 應(yīng) 體 系為: SYBR Premix ExTaq 6 μL;正向引物(10 μmol/L)0.5 μL;反向引物(10 μmol/L)0.5 μL;模板 0.5 μL;雙蒸水5 μL;總體積為 12.5 μL,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。RT-PCR結(jié)束后,從擴(kuò)增曲線得出Ct值,通過公式RQ=2–△△Ct[ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)－ΔCt校準(zhǔn)樣]計(jì)算得出目的基因的相對表達(dá)量,最后用Sigmaplot軟件作圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

用 Image-pro plus6.0軟件分析腸道切片圖,所有數(shù)據(jù)都用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)”的表示方法,并用 Excel 2007進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),采用Duncan進(jìn)行多重比較,檢驗(yàn)不同組間的差異是否顯著,以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。柱狀圖由專業(yè)制圖軟件 Sigmaplot制出。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋a魚生產(chǎn)性能的影響

從表3可見,1.0、2.5、4.0和9.0 g/kg四個(gè)處理組與對照組相比較,鯽魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)差異不顯著(P＞0.05),當(dāng)?；撬崽砑恿繛?.0 g/kg時(shí),鯽魚的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)顯著高于對照組及其它處理組(P＜0.05)。從表3還可知,1.0、2.5和9.0 g/kg三個(gè)處理組與對照組相比,鯽魚蛋白質(zhì)效率差異不顯著(P＞0.05),4.0 g/kg和6.0 g/kg處理組蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組及其它處理組(P＜0.05)。

2.2 ?；撬釋a魚血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知,血清中T3、T4隨著?；撬釀┝康脑黾?各試驗(yàn)組整體呈先增加后下降的變化趨勢,?；撬釢舛?.0 g/kg時(shí),T3、T4在血清中濃度最高,顯著高于對照組和1.0 g/kg、2.5 g/kg處理組(P＜0.05)。各試驗(yàn)組血清葡萄糖濃度差異不顯著(P＞0.05),尿素氮濃度差異顯著(P＜0.05),6.0 g/kg處理組中尿素氮濃度顯著低于對照組和其它處理組(P＜0.05)。

2.3 ?；撬釋a魚腸道細(xì)胞增殖的影響

由表5可知,絨毛高度整體上隨著牛磺酸濃度的增加而先上升后下降,隱窩深度則隨著?；撬釢舛鹊脑黾酉冉档秃笤黾?。當(dāng)飼料中?；撬釢舛葹?.0 g/kg時(shí),鯽魚絨毛高度達(dá)到最高值,隱窩深度達(dá)到最小值,且都顯著區(qū)別于對照組和其它處理組(P＜0.05)。而且,各試驗(yàn)組的絨毛高度/隱窩深度的比值隨著牛磺酸濃度的增加先增大后減小,添加6.0 g/kg時(shí)達(dá)到最高值(見圖1)。

2.4 牛磺酸對腸道蛋白吸收調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2、圖3所示,APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達(dá)量隨著?；撬崽砑恿康脑黾诱w上都呈先上升后下降的變化趨勢,添加6.0 g/kg時(shí)處于最高值,顯著高于對照組和其它處理組(P＜0.05)。從圖2可看出,1.0和4.0和6.0 g/kg處理組的APN mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05);PepT1 mRNA表達(dá)量在6.0 g/kg處理組時(shí)顯著高于其它試驗(yàn)組(P＜0.05),除6.0 g/kg處理組之外的其它組間則差異不顯著(P＞0.05)。由圖3可看出,LAT2在 4.0 g/kg和6.0g/kg處理組時(shí)表達(dá)量顯著高于其它試驗(yàn)組(P＜0.05)。CDX2 mRNA在6.0g/kg和9.0 g/kg處理組的相對表達(dá)量高于對照組和其它處理組(P＜0.05)。綜上說明添加適量的?；撬崮艽龠M(jìn)APN、PepT1、LAT2和CDX2 這4個(gè)基因的表達(dá),而添加量過低或者是過 高則不起作用或者起抑制的效果。

表3 不同?；撬崃繉a魚生產(chǎn)性能的影響Tab.3 Effects of different concentrations of taurine on growth performance of crucian carp

表4 不同牛磺酸量對鯽魚血液生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effect of taurine in different concentrations on biochemical indices in crucian carp serum

表5 不同?；撬崃繉a魚腸道黏膜形態(tài)的影響Tab.5 Effect of taurine in different concentrations on intestinal mucosa morphology of crucian carp

3 分析與討論

國內(nèi)外有關(guān)?；撬嵊绊懰a(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)性能的研究報(bào)道很多,Takagi等(2006b)用添加不同梯度牛磺酸的飼料飼喂黃魚,研究結(jié)果表明,飼喂 21周后,0添加?；撬峤M的魚的增重,飼料效率明顯比添加組低,而死亡率則更高。Takagi等(2006a)在飼料中添加梯度劑量的?；撬犸曃?1年齡的紅鯛魚,發(fā)現(xiàn)?；撬崽砑咏M的特定生長率和飼料利用率得到明顯的改善。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在飼料中添加一定劑量的?；撬釋a魚有明顯的促生長和促進(jìn)飼料利用的作用,6.0 g/kg?；撬崽幚斫M的生產(chǎn)指標(biāo)最優(yōu),顯著優(yōu)于對照組和其它處理組(P＜0.05),本研究結(jié)果與上述報(bào)道相似。

甲狀腺激素的主要作用是通過加快新陳代謝來促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育。T3、T4都是機(jī)體的重要代謝激素,與生長激素密切相關(guān),其水平的高低影響著機(jī)體代謝水平、生長快慢(宋永,2002;楊小然,2012)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,T3、T4都隨著牛磺酸添加濃度的增加而先增加后減少,當(dāng)添加濃度達(dá)到6.0 g/kg時(shí),T3、T4都達(dá)到最高值,這與郭鵬飛(2004)研究?；撬釋θ怿喲荷笜?biāo)的結(jié)果一致。血清尿素氮含量主要反映體內(nèi)氨基酸的代謝效率,血清中尿素氮含量的增加是因?yàn)檫^量的氨基酸在體內(nèi)進(jìn)行脫氨作用,有研究報(bào)道,尿素氮含量與蛋白質(zhì)利用率及日增重呈負(fù)相關(guān)(Whang et al,1994)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,1.0、4.0、6.0 g/kg牛磺酸添加組的尿素氮含量顯著低于對照組(P＜0.05),其中6.0 g/kg處理組最低,表明鯽魚飼料中添加?；撬峥山档脱迥蛩氐獫舛?這一研究結(jié)果與劉玉芝等(2008)的肉仔雞牛磺酸試驗(yàn)結(jié)果相互佐證。

圖2 ?；撬釋a魚腸道APN、PepT1 mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of taurine on APN,PepT1 mRNA relative expression of the crucian carp

圖3 ?；撬釋a魚腸道 LAT2、CDX2 mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of taurine on LAT2,CDX2 mRNA relative expression of the crucian carp

腸絨毛作為機(jī)體的主要消化和吸收場所,是腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)。衡量小腸吸收功能的指標(biāo)主要是腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度與隱窩深度的比值(韓正康,1991;晁洪雨,2008)。腸絨毛高度增加使腸道吸收面積加大,對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率得到提高,消化功能增強(qiáng),提高魚的生長性能和飼料系數(shù)。隱窩變淺使腸道分泌功能加強(qiáng)(成令忠,1994),能分泌更豐富的激素,酶類,提高了腸道的消化吸收能力。腸絨毛吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力隨著腸絨毛高度與隱窩深度比值的增高而加強(qiáng),反之則減弱(郭元晟等,2011;郭志強(qiáng)等,2012)。張建斌等(2011)報(bào)道,在飼料中添加?；撬崮軜O顯著提高豬十二指腸的絨毛長度和降低隱窩深度,極顯著提高十二指腸段和空腸中腸段的絨毛長度/隱窩深度。本試驗(yàn)結(jié)果與以上試驗(yàn)結(jié)果相似,添加適量的?；撬崮苁沟酶吣c絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度的比值得到顯著提高,隱窩深度顯著降低,尤其是6.0 g/kg添加量時(shí),各數(shù)據(jù)均顯示達(dá)到了最佳。

?；撬嵊绊戵w內(nèi)蛋白質(zhì)的消化吸收效率,根本原因是牛磺酸對調(diào)控蛋白質(zhì)水解、轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收相關(guān)基因表達(dá)起了調(diào)控作用。APN作為魚類腸道中水解各種蛋白質(zhì)的關(guān)鍵酶,能夠把 N端多肽鏈水解成游離氨基酸,對魚類的消化有著至關(guān)重要的作用(Nakainishi et al,2002)。PepT1對大多數(shù)二肽和三肽都具有很高的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,在蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用(張?jiān)迫A等,2003)。CDX2在腸道中主要對腸道上皮形態(tài)發(fā)生,維持和分化起作用,是腸道上皮細(xì)胞的一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子(Yuasa et al,2005),還調(diào)控一些對腸道消化吸收起關(guān)鍵性作用的功能基因的表達(dá)(馮幼等,2009)。LAT2負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)支鏈氨基酸和芳香族氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸(Kanai et al,1998)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,牛磺酸對 APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達(dá)量的影響整體上都是一個(gè)先上升后下降的變化趨勢,當(dāng)牛磺酸濃度達(dá)到6.0 g/kg時(shí)處于最高值,顯著高于對照組和其它對照組(P＜0.05),這與Matsunari等(2005)研究?；撬釋S鰤魚幼魚的影響的研究結(jié)果相似,即?；撬崮苡绊懓被岽x。以上研究結(jié)果揭示?；撬嵬ㄟ^調(diào)節(jié)APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA在鯽魚腸道中的相對表達(dá)量來調(diào)控蛋白質(zhì)的水解,小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)以及氨基酸的消化吸收,最終影響到鯽魚的生長性能。

4 結(jié)論

(1)飼料中添加適量的?；撬崮芴岣喏a魚的生長性能、蛋白質(zhì)效率、飼料系數(shù)、及鯽魚腸道細(xì)胞的增殖和血清中T3、T4的濃度。

(2)飼料中添加適量的?；撬崮苌险{(diào)鯽魚腸道中APN、PepT1、LAT2、CDX2 mRNA的相對表達(dá)量。

(3)飼料中添加?；撬釕?yīng)注意適量原則。

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