王世山 陳艷可 楊俊

（中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所 武漢磁共振中心 波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢 430071）

膜蛋白原核表達的基因序列優(yōu)化

王世山 陳艷可 楊俊

（中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所 武漢磁共振中心 波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢 430071）

膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究是當前的熱點之一。目前獲取膜蛋白的最主要途徑是通過原核系統(tǒng)進行表達。但是膜蛋白在原核系統(tǒng)中表達水平相對較低，通過對基因序列進行優(yōu)化促使膜蛋白正確高效表達是一項非常重要的技術(shù)手段。歸納了近些年來膜蛋白原核表達技術(shù)在基因序列優(yōu)化研究上的最新進展，并從稀有密碼子的優(yōu)化、mRNA的穩(wěn)定性與翻譯起始、mRNA與核糖體行為、翻譯的效率與膜蛋白的折疊4個方面對基因序列上影響膜蛋白表達的因素進行了總結(jié)，旨在為膜蛋白的原核表達提供一定的思路和參考。

膜蛋白；超量表達；基因序列優(yōu)化；密碼子優(yōu)化；mRNA穩(wěn)定性；翻譯速率；膜蛋白折疊

膜蛋白在生物體的許多生命活動中起著非常重要的作用，如細胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號轉(zhuǎn)導及物質(zhì)運輸?shù)?。目前有大約60%的藥物作用靶點是膜蛋白［1］。關(guān)于膜蛋白結(jié)構(gòu)的研究對探究疾病的發(fā)病機理和有效治療有著重要意義，也是當前的研究熱點之一。研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的技術(shù)包括X射線衍射、核磁共振波譜、電子顯微鏡、原子力顯微鏡、紅外光譜和圓二色譜等。其中X射線衍射和核磁共振波譜技術(shù)是對膜蛋白三維結(jié)構(gòu)進行研究的主要方法。尤其利用固體核磁共振技術(shù)（Solid state NMR）可在接近膜蛋白的天然環(huán)境的磷脂雙分子層中研究膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息和動力學特征，在膜蛋白結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景［2，3］。采用固體核磁共振研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，需要制備大量的同位素富集的膜蛋白樣品，重組表達就成為了獲取膜蛋白樣品的重要手段。常用于重組膜蛋白的表達系統(tǒng)有真核表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)和近些年來發(fā)展的無細胞表達系統(tǒng)。其中以大腸桿菌（E.coli）為代表的原核表達系統(tǒng)因為操作簡單、成本相對低廉、遺傳背景清楚、方便同位素標記，以及有大量可利用的表達載體和宿主菌株等原因，是目前獲取重組膜蛋白的最主要途徑。對于一些膜蛋白而言，采用增加蛋白可溶性或者促使蛋白形成包涵體的標簽進行融合表達，是很好的增加蛋白產(chǎn)量的辦法，但是目前還沒有普遍有效的融合標簽可用于所有膜蛋白的超量表達［4-6］。因此，如何提高蛋白表達量一直是膜蛋白三維結(jié)構(gòu)研究過程中首先需要解決的問題。本文歸納了近些年來基因序列優(yōu)化在膜蛋白原核表達技術(shù)研究上的最新進展，并從稀有密碼子的優(yōu)化、mRNA的穩(wěn)定性與翻譯起始、mRNA與核糖體行為、翻譯的效率與膜蛋白的折疊4個方面對基因序列影響膜蛋白表達的優(yōu)化因素進行了總結(jié)，旨在對原核系統(tǒng)中膜蛋白的超量表達提供一些思路和參考。

1 膜蛋白基因序列特點

基因的堿基序列上攜帶的遺傳信息，不僅決定了所合成肽鏈的氨基酸組成和順序，還會影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，這些遺傳信息是決定蛋白質(zhì)豐度的主要原因［7］。膜蛋白通常含有一個或幾個疏水性很強的跨膜片段，其組成以疏水性氨基酸殘基為主［8］。編碼疏水性氨基酸的密碼子中，其尿嘧啶含量要明顯高于親水性氨基酸的密碼子［9］，與可溶蛋白相比膜蛋白在基因組轉(zhuǎn)錄中處于明顯劣勢［10，11］，這種堿基特異性是可能原因之一。此外，在膜蛋白基因序列上還存在影響蛋白折疊和插入的信號，它們對膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的保持至關(guān)重要。對多藥耐藥基因的研究發(fā)現(xiàn)，同義密碼子的替換會影響其產(chǎn)物P-糖蛋白折疊和插入膜的時機，從而使P-糖蛋白底物特異性發(fā)生改變［12］。在啤酒酵母膜蛋白的跨膜區(qū)后第45個密碼子及第75個密碼子左右經(jīng)常會出現(xiàn)一些翻譯暫停信號，由于翻譯過程中核糖體通道正好可以容納30-72個氨基酸，這些信號可能與新合成的跨膜區(qū)的折疊有關(guān)［13，14］。

因此，對于外源膜蛋白在原核表達系統(tǒng)中出現(xiàn)的表達水平低、可溶性差、易錯誤折疊和聚集的現(xiàn)象［4，15］，在具體實踐中結(jié)合表達宿主對目的基因進行堿基序列優(yōu)化是促使膜蛋白高效，且正確表達的一項十分常用的解決手段［4，16，17］。

2 膜蛋白基因序列的優(yōu)化分析

蛋白的表達是遺傳信息從基因的DNA序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯和肽鏈折疊而形成蛋白質(zhì)等一系列的過程。因此膜蛋白基因序列的優(yōu)化會涉及到mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯的效率以及翻譯過程中肽鏈的折疊等等多個方面。下面將從稀有密碼子優(yōu)化、mRNA的穩(wěn)定性與翻譯起始、mRNA與核糖體行為、翻譯的效率與膜蛋白的折疊四個方面進行介紹。

2.1 稀有密碼子的優(yōu)化

除甲硫氨酸和色氨酸之外，其他的氨基酸至少對應兩個密碼子。不同物種之間對密碼子的偏好有明顯差異，使用頻率低的密碼子被稱為稀有密碼子［18，19］。大量研究表明，稀有密碼子的存在會影響膜蛋白的最終表達水平，因此異源表達的膜蛋白通常要在基因序列上對密碼子進行優(yōu)化［9，17，20-22］。許多膜蛋白，如秀麗隱桿線蟲氯離子通道蛋白（Caenorhabditis elegans GluCl ion channel）、人類細胞色素P4504F11（Human cytochrome P450 4F11）、G蛋 白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor）等，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后在大腸桿菌中得到了良好的表達［22-25］。除此之外，稀有密碼子的出現(xiàn)在有些情況下還會造成點突變甚至移碼突變，從而表達出序列錯誤的多肽。如有些情況下稀有密碼子AGA編碼的精氨酸（Arg）會被錯誤翻譯成賴氨酸（Lys）［26］，串聯(lián)的稀有密碼子如AGG-AGG、AGA-AGA及3個連續(xù)的CGG可能會造成閱讀框的改變［27，28］，終止密碼子UGA被翻譯成色氨酸（Trp）造成通讀而產(chǎn)生后續(xù)的冗余序列［29］。因此，應該避免在膜蛋白的基因序列中含有大量稀有密碼子，對此最直接的辦法是對基因序列中的密碼子進行優(yōu)化，目前有Codon Usage Analyzer、Graphical Codon Usage Analyzer等許多在線程序或網(wǎng)站可以利用。另一種解決方式是采用帶有稀有密碼子額外拷貝的表達菌株，如已經(jīng)商業(yè)化的BL21 Codon Plus或Rosetta菌株，這在一定程度上也可以避免或減輕稀有密碼子造成的不良影響［20，30］。

值得一提的是，大腸桿菌在不同的培養(yǎng)基中對密碼子的偏好性可能會發(fā)生變化，比如2012年，Weissman課題組發(fā)現(xiàn)絲氨酸密碼子在LB培養(yǎng)基和含葡萄糖的富營養(yǎng)培養(yǎng)基中表現(xiàn)有很大差異［31］。但到目前為止，這種關(guān)于培養(yǎng)基成分對大腸桿菌密碼子偏好性影響的研究并不多見。

2.2 mRNA的穩(wěn)定性與翻譯起始

mRNA的降解是影響膜蛋白基因高效表達的重要因素。mRNA的降解與其自身的堿基序列有很大關(guān)聯(lián)，一個堿基的突變就可能會使mRNA穩(wěn)定性出現(xiàn)巨大變化，從而導致膜蛋白的最終表達水平大受影響。以大腸桿菌OmpA蛋白和人體多巴胺D2型受體（DRD2）為例：當OmpA基因5'端的密碼子被一些不常用的同義密碼子取代后，mRNA的半衰期縮短了4倍，mRNA水平和最終的蛋白產(chǎn)量都降低了10倍［32］；至于DRD2基因，當?shù)?57位的胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）替換后，mRNA的半衰期從8 h降至4 h，蛋白產(chǎn)量也下降到了原來的50%，但是同時將第1101堿基突變?yōu)橄汆堰剩ˋ）后，mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達水平又恢復正常［33］。mRNA的降解還可能與其第20-45個密碼子的裸露有密切關(guān)聯(lián)，在這一段序列前面或后面加一些低翻譯速率的密碼子分別可以縮短或延長mRNA的半衰期，原因可能是核糖體在這段序列上更長時間的停留和包裹可以保護mRNA免于被降解［34］。

在mRNA起始密碼子附近的-4-+37位堿基處避免形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)對于蛋白的表達非常重要，這正是核糖體在翻譯起始的部位［35］。mRNA 5'端臨近翻譯起始部位疏松的二級結(jié)構(gòu)有利于核糖體亞基的快速識別和重組，提高翻譯的起始效率［7］。高效的翻譯起始和延伸，一方面加快了肽鏈的合成速率；另一方面，由于核糖體迅速的結(jié)合在一定程度上抑制了mRNA自身的降解，使轉(zhuǎn)錄出來的mRNA保持一個比較高的水平［7］。在有些條件下，mRNA 5'端二級結(jié)構(gòu)的優(yōu)化甚至比全局的密碼子優(yōu)化對膜蛋白基因的表達影響更為明顯［17，20，35］。如對人體神經(jīng)細胞突觸回蛋白和大腸桿菌FtsH蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，膜蛋白的表達水平與其N端氨基酸密碼子選擇不同而導致的mRNA 5'端的二級結(jié)構(gòu)變化有著很大關(guān)系［20，36］。事實上，很多高表達基因為了使mRNA 5'端保持有利于翻譯起始的二級結(jié)構(gòu)而不得不在密碼子偏好性上作出妥協(xié)［37-39］。因此，運用聚合酶鏈式反應（PCR）等技術(shù)對基因序列的5'端進行改造或者添加一些堿基降低翻譯起始部位mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是使膜蛋白獲得高效表達的一個有效手段［17，40］。

2.3 mRNA與核糖體行為

膜蛋白基因序列的優(yōu)化還需要考慮到核糖體誘捕和類似核糖體結(jié)合序列（SD序列）等影響核糖體行為的因素。在蛋白質(zhì)的合成過程中，一條mRNA通常會同時結(jié)合多個核糖體，每個核糖體合成一條肽鏈，它們的相對獨立并同時進行使得翻譯過程十分高效。但是，mRNA上密碼子的使用不僅影響到核糖體在某個位置的移動速率，還會關(guān)系到相鄰核糖體之間的距離，在整體翻譯速率非常快的情況下，后面有一個翻譯速率慢的密碼子有可能引起核糖體的碰撞和形成隊列，這通常會使這些核糖體被誘捕而長時間不能移動，從而影響了翻譯的效率，因此在序列優(yōu)化時需要防止翻譯過程中核糖體的碰撞和隊列來節(jié)省翻譯的時間［41］。另外，膜蛋白基因中類似核糖體結(jié)合序列（SD序列）的結(jié)構(gòu)也是一個不能忽略的因素。一方面，類SD序列的存在可能會使核糖體在該位置上被長時間扣押而導致翻譯停滯，極大地降低肽鏈延伸速率甚至造成蛋白合成提前終止；另一方面，原核表達是轉(zhuǎn)錄和翻譯的耦合，終止密碼子附近的類SD序列導致核糖體在翻譯即將結(jié)束時移動減速，使其不會影響到終止子莖環(huán)結(jié)構(gòu)的折疊從而確保轉(zhuǎn)錄的正常終止［31］。

2.4 翻譯的效率與膜蛋白的折疊

膜蛋白基因攜帶的遺傳信息還會調(diào)節(jié)翻譯的肽鏈的折疊、復合物的形成及膜蛋白的插入等［12，42］。適時的翻譯速率的減緩對膜蛋白在大腸桿菌中正確表達是非常重要的，慢的翻譯速率可以讓超量表達的膜蛋白更好地折疊、定位并保真［43］。如對蛋白家族數(shù)據(jù)庫（Pfam）的統(tǒng)計顯示，許多與膜相關(guān)的蛋白質(zhì)都有很長的稀有密碼子簇，這些稀有密碼子簇大都在前130個氨基酸殘基內(nèi)，并且在靠近N端的區(qū)域稀有密碼子的數(shù)量會大幅攀升。在基因表達的過程中，稀有密碼子簇引起的翻譯的減速或暫停，有利于初始合成的肽鏈在核糖體通道里形成所需的α螺旋結(jié)構(gòu)。離開核糖體后，α螺旋上的疏水殘基與水環(huán)境相互作用，快速地重新排列形成更為復雜的結(jié)構(gòu)，所以存在于膜蛋白結(jié)構(gòu)域之間的稀有密碼子簇的一個作用可能就是通過形成多個翻譯暫停，對蛋白結(jié)構(gòu)進行分步包裝，使蛋白正確地折疊和定位。因此在基因編碼區(qū)設(shè)置適當?shù)姆g暫停位點對于膜蛋白結(jié)構(gòu)的正確形成，如跨膜螺旋的折疊，有很好的促進作用［42］。

3 總結(jié)

我們從稀有密碼子的優(yōu)化、mRNA的穩(wěn)定性與翻譯起始、mRNA與核糖體行為、翻譯的效率與膜蛋白的折疊4個方面對基因序列上影響膜蛋白表達的優(yōu)化因素進行了總結(jié)，并列舉了一些優(yōu)化方案和成功實例?；虻男蛄袃?yōu)化工作是膜蛋白原核表達的重要開端，在實際操作過程中多個因素之間經(jīng)常會相互影響，必要的時候可能需要作出一定程度的妥協(xié)才能得到最優(yōu)的序列，一段合適的基因序列可以讓后面的表達純化工作達到事半功倍的效果。目前對于mRNA降解、翻譯暫停和膜蛋白折疊等過程的認識還不夠充分，所以膜蛋白基因序列的優(yōu)化也還需要未來更多工作的支持。膜蛋白的表達本身是多個過程的綜合考量，除了本文所講的基因序列優(yōu)化外，后續(xù)的表達載體、融合標簽以及宿主菌的選擇、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等也是膜蛋白高效表達時應該認真考慮和設(shè)計的工作。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Gene Sequence Optimization of Membrane Protein in Prokaryotic Expression System

Wang Shishan Chen Yanke Yang Jun
（State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics，Wuhan Centre for Magnetic Resonance，Wuhan Institute of Physics and Mathematics，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430071）

Studies of the structure and function of membrane proteins are hotspots of life science in recent years. The most important approach to acquire membrane protein is recombinant expression in prokaryotic system. However， the yield of membrane protein in prokaryotic system is relatively low. Gene sequence optimization is a effective technique to enhance expression of membrane protein in prokaryotic system. In this article， we summarize the latest progress on gene sequence optimization for the prokaryotic expression of membrane proteins， and discuss the factors which affect the expression of membrane protein， including the optimization of rare codons， mRNA stability and translation starting，mRNA and ribosome behaviour， translation rate and membrane protein folding. Our paper provides new possibilities for the over-expression of membrane protein in prokaryotic system. .

membrane protein；over-expression；gene sequence optimization；rare codons optimization；mRNA stability；translation rate；membrane protein folding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.007

2015-03-03

王世山，男，碩士研究生，研究方向：膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：seebinghe@foxmail.com

楊俊，E-mail：yangjun@wipm.ac.cn