吳楠 郭楊柳 王曉珊 李艷云 盧會鵬 陳翠珍 張東林 房海

（河北科技師范學院，秦皇島 066000）

東亞飛蝗蟲病原褪色沙雷氏菌的鑒定與檢驗

吳楠 郭楊柳 王曉珊 李艷云 盧會鵬 陳翠珍 張東林 房海

（河北科技師范學院，秦皇島 066000）

病原褪色沙雷氏菌的有效分離與鑒定對控制由褪色沙雷氏菌引起的養(yǎng)殖東亞飛蝗感染病均具有一定的參考與應(yīng)用價值，同時將為對蝗災(zāi)的生物防治研究提供借鑒。對從發(fā)病死亡的養(yǎng)殖東亞飛蝗中分離的10株細菌，進行了表觀分類學指征、16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育、人工感染的致病作用等方面的檢驗與分析。結(jié)果表明為沙雷氏菌屬的褪色沙雷氏菌，對供試養(yǎng)殖東亞飛蝗顯示強致病性。褪色沙雷氏菌對東亞飛蝗有強致病性，是蝗蟲養(yǎng)殖的重要致病菌。

東亞飛蝗；褪色沙雷氏菌；檢驗與分析

蝗蟲（Locust）屬于直翅目（Orthoptera）、蝗科（Locustidae）的昆蟲，包括多個種（Species）。在歷史上蝗災(zāi)給世界帶來的生態(tài)平衡破壞與經(jīng)濟損失是極其驚人的，屬于世界性的災(zāi)害；糧食作物一旦發(fā)生蝗災(zāi)，可使產(chǎn)量降低30%-70%，在1 d內(nèi)就能吞食掉12萬人1個月的口糧。在全球除南極洲、歐亞大陸北緯55°以北地區(qū)外均有蝗災(zāi)發(fā)生，常年發(fā)生面積達4 680 km2，全球有1/8的人口經(jīng)常受到蝗蟲的襲擾［1，2］。近年來，全國不少地方開始人工養(yǎng)殖蝗蟲用作高蛋白食物，并有逐漸形成產(chǎn)業(yè)的趨勢，養(yǎng)殖品種主要是東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis），利用大棚溫室養(yǎng)殖相對比較多見。隨著蝗蟲人工養(yǎng)殖生產(chǎn)的出現(xiàn)，成批的蝗蟲發(fā)病死亡現(xiàn)象也時有發(fā)生。為探討蝗蟲發(fā)病死亡的原因，本研究對1起飛蝗蟲病害進行病原學檢驗，對分離的病原菌株進行表觀性狀和分子生物學等鑒定，旨在對養(yǎng)殖東亞飛蝗感染病進行有效檢驗、預(yù)防與控制，為蝗災(zāi)進行生物防治提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2012年7月，河北某實驗養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的5齡東亞飛蝗發(fā)生大量的死亡；死亡蝗蟲主要表現(xiàn)發(fā)病死亡急劇，蟲體發(fā)紅褐色和軟化。在7月上旬的發(fā)病死亡高峰期時，取發(fā)病后剛剛死亡蟲體，蒸餾水清洗75%酒精消毒，在無菌的條件下內(nèi)，取其腔體內(nèi)組織為材料，在生理鹽水中搗碎，平鋪接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7%家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)24-48 h；對分離菌平板畫線做純培養(yǎng)并統(tǒng)一編號后，進行檢驗與分析。

1.2 分離菌株的表觀分類學指征檢驗

對分離保存的純培養(yǎng)菌株，分別進行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性等這些表觀分類學指征的系統(tǒng)檢驗。生理生化特性檢驗，采用法國BioméRieux細菌自動鑒定儀（ATB1525-expression），并對一些項目內(nèi)容進行補充試驗［3］。

1.3 分離菌株的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析

選擇經(jīng)表觀分類學指征檢驗后的代表菌株，進行16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析。將供試菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，28℃（110 r/min）振蕩培養(yǎng)16 h作為供試菌液，采用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒， 參照相應(yīng)的方法提取細菌DNA作為PCR模板。

以對應(yīng)于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rRNA基因第8-27個堿基位置的5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3'為正向引物、對應(yīng)于大腸埃希氏菌16S rRNA基因第1492-1510 個堿基位置的5'-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3'為反向引物（1492R），按常規(guī)方法對供試菌株進行16S rRNA基因序列的PCR擴增［4］。在50 μL反應(yīng)體系中含有2×PCRmix緩沖液25 μL、引物各 1 μL、模板DNA 4 μL、無菌蒸餾水19 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min、接94℃變性1 min、55℃復(fù)性1 min、72℃延伸 2 min，經(jīng)30個循環(huán)后72℃溫育6 min。所擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，提交上海生工生物工程股份有限公司進行基因序列測定。

對所測定的基因序列，通過NCBI的BlAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，使用DNASTAR軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫存中獲得的相似性較高的基因序列進行多序列匹配排列（Multiple alignment），采用鄰接法（Neighbor joining method）構(gòu)建分支系統(tǒng)樹。

1.4 菌株分類位置確定

根據(jù)細菌形態(tài)特征、理化特性等表觀分類學指征的檢驗結(jié)果，主要參照第2版《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》及有關(guān)資料，并結(jié)合16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學的測定結(jié)果，對供試菌株進行分類學的歸類判定［3，5］。

1.5 人工感染試驗

選擇經(jīng)分類鑒定后的代表菌株，以其純培養(yǎng)物分別移接普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，經(jīng) 30℃培養(yǎng)18 h作為供試菌液，分別對5齡健康的養(yǎng)殖東亞飛蝗進行人工感染實驗并將試驗重復(fù)3次。方法是取同批養(yǎng)殖東亞飛蝗，分組養(yǎng)殖于實驗箱中；將供試菌液涂布或噴灑到鮮嫩玉米葉上，使蝗蟲自然采食（相當于通過消化道途徑接種感染）。接種后每天定時觀察記錄發(fā)病或死亡情況，以被感染發(fā)病、死亡，呈現(xiàn)出同自然?。ㄋ溃┗认x的發(fā)病特征、并能從死亡蟲體重新分離回收到原感染菌作為致病作用的判定指標，同時設(shè)立僅接種無菌普通營養(yǎng)肉湯的實驗對照。供試蝗蟲在實驗前統(tǒng)一養(yǎng)殖于實驗箱中，養(yǎng)殖觀察3 d且健康才可用于實驗。

2 結(jié)果

2.1 菌株與編號

取發(fā)病后剛剛死亡的養(yǎng)殖東亞飛蝗50只進行細菌分離，從其腔體內(nèi)組織中，均分離到了多量細菌，且明顯存在呈優(yōu)勢生長的同種細菌。從不同蟲體的分離菌，各取1個呈優(yōu)勢生長的同種細菌的菌落移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)24 h作為純培養(yǎng)菌共10株，于4℃普通冰箱保藏供實驗用。菌株編號系按分離地與日期，依次為HC120710-1至HC120710-10。

2.2 形態(tài)與培養(yǎng)特征

2.2.1 形態(tài)特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)24 h后做涂片標本進行革蘭氏染色檢查，均為革蘭氏染色陰性、兩端鈍圓、散在（個別成雙）、無芽孢的桿菌。做負染色的透射電子顯微鏡標本觀察（圖1），菌體桿狀、表面光滑但不平整、有微泡（Micorovesicale）、周生鞭毛及菌毛。

圖1 褪色沙雷氏菌透射電子顯微鏡照片（×8 000）

2.2.2 生長情況與菌落特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7%家兔血液）營養(yǎng)瓊脂、沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂（Salmonella-Shigella agar，SS agar）培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)24-48 h培養(yǎng)后檢查生長情況及菌落特征。結(jié)果在普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7%家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，與用這兩種培養(yǎng)基從病死東亞飛蝗蟲體所分離的一致，表現(xiàn)為在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h檢查菌落呈圓型光滑、邊緣整齊、較隆起、醬紅色、不透明、直徑多在1.5 mm（培養(yǎng)48 h的多在2.0-2.5 mm），生長豐盛；在血液（含7%家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生長情況、菌落特征與在普通營養(yǎng)瓊脂上的基本相同，β-溶血；在SS瓊脂培養(yǎng)基上，生長情況、菌落特征與在普通營養(yǎng)瓊脂上的基本相同，呈淺玫瑰紅色。

2.2.3 適宜生長的溫度 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24-48 h檢查，表現(xiàn)與在30℃培養(yǎng)的生長情況相同，但不能明顯產(chǎn)生紅色色素。

2.3 理化特性

供試10株純培養(yǎng)菌，對所測項目的結(jié)果表現(xiàn)一致。主要為：氧化酶、酯酶、精氨酸雙水解酶、L-天冬氨酸芳胺酶、尿素酶等陰性，過氧化氫酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等陽性；吲哚陰性，V-P陽性，利用檸檬酸鹽，不利用丙二酸鹽。分解葡萄糖、阿拉伯醇、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、側(cè)金盞花醇、肌醇、山梨醇等，不分解纖維二糖、棉籽糖、甘露醇、鼠李糖、阿拉伯糖等。

2.4 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育

選擇經(jīng)表觀分類學指征檢驗后的HC120710-1作為代表菌株，進行的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析，結(jié)果得到了長度為1 428 bp的基因序列。將此菌株的16S rRNA序列在NCBI上進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與沙雷氏菌屬細菌的16S rRNA基因序列自然聚類；在檢索出的沙雷氏菌屬細菌序列中，此菌株與它們的同源性都在99%-98%。選取17株沙雷氏菌屬細菌的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育學分析（圖2），此菌株與編號為JQ308604的褪色沙雷氏菌聚為一個分支。

2.5 菌種判定

根據(jù)對10株供試菌表觀分類學指征的檢驗、結(jié)合16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學分析結(jié)果，綜合分析判定為沙雷氏菌屬的褪色沙雷氏菌［3-7］。參考菌株：HC120710-1。

2.6 致病作用

將同批5齡健康的養(yǎng)殖東亞飛蝗，分為每組約100只的兩組隔離養(yǎng)殖于兩個實驗箱中；其中的1組接種供試菌株HC120710-1的菌液為感染實驗組，另外1組接種普通營養(yǎng)肉湯為實驗對照組，接種時間為2013年7月8日（7-8），接種后分別養(yǎng)殖觀察至7月13日共6 d（144 h），每天觀察發(fā)病與統(tǒng)計死亡情況。結(jié)果為實驗組的95只共死亡73只（死亡率76.84%），對照組的96只共死亡31只（死亡率32.29%），死亡時間及數(shù)量，見表1。

接種感染試驗組的蝗蟲，多數(shù)具有行動遲緩（不活躍），少食甚至停食，有的還出現(xiàn)輕微的痙攣現(xiàn)象等發(fā)病表現(xiàn)；病死蝗蟲多數(shù)表現(xiàn)為蟲體逐漸變軟、變黑褐色，與自然發(fā)病死亡的表現(xiàn)基本一致。對照組中死亡的蝗蟲，一般缺乏明顯的發(fā)病特征。隨機擇感染試驗組及對照組死亡的蝗蟲各5只，分別取其腔體內(nèi)組織為材料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7%家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃培養(yǎng)24-48 h；結(jié)果從感染試驗組的5只中均分離出了呈優(yōu)勢生長的原感染用褪色沙雷氏菌，對照組的5只均未檢出。對照組后期死亡數(shù)增加，有可能是飼養(yǎng)條件不適引起的死亡。

圖2 褪色沙雷氏菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

表1 蝗蟲感染試驗結(jié)果表

3 討論

對從發(fā)生死亡的養(yǎng)殖東亞飛蝗蟲體分離的10株細菌，經(jīng)比較系統(tǒng)的檢驗表明為褪色沙雷氏菌；人工感染養(yǎng)殖的五齡健康東亞飛蝗的實驗結(jié)果，顯示具有一定的致病作用。這些結(jié)果，可以為對褪色沙雷氏菌的有效檢驗提供有價值的參考。

腸桿菌科［Enterobacteriaceae（Rahn 1937）Ewing Farmer and Brenner 1980］，首先由德裔-美國微生物學家奧托·拉恩（Otto Rahn）于1937年所建立。追溯歷史，褪色沙雷菌是最早發(fā)現(xiàn)和研究的腸桿菌科細菌成員。早在公元前322年，就已有在食物中自然出現(xiàn)“血”的記載；19世紀初，在歐洲認為這種“血”的現(xiàn)象，是發(fā)酵的終產(chǎn)物或是由在當時定名為“Zaogalactina imetropha”的真菌（fungi）所致。1819年，在意大利東北部港市威尼斯的藥劑師巴爾托洛梅奧·比茲奧（Bartolomeo Bizio），通過對這種生長在意大利大麥粥上“血粥”的檢驗，發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)生這種紅色物質(zhì)的細菌，并于1823年將其命名為“Serratia marcescens”（褪色沙雷氏菌），但沒有發(fā)現(xiàn)該菌具有病原學意義。屬名“Serratia”（沙雷氏菌屬），是以意大利物理學家拉塞菲諾·沙雷（Serafino Serrati）的姓氏命名的［7］。

在褪色沙雷氏菌的致病作用方面，已有的報告顯示在人的醫(yī)院感染中具有一定的病原學意義；另外是Garcia等［12］曾報告該菌在1名兒童所引發(fā)的腿部潰瘍和皮膚肉芽腫病例，Langrock等［8-13］報告了該菌在1名73歲患者所引發(fā)的腿部潰瘍和膿腫病例，但這些都是罕見的。對動物的致病，有記述該菌是與母牛的乳腺炎和膿毒性流產(chǎn)有關(guān)的；Plavec等［14］曾報告該菌引發(fā)了1例犬的壞死性筋膜炎，Nam等［15］報告在朝鮮的牛乳腺炎病原菌中包括該菌。對昆蟲類動物的致病性，有記述該菌能引起家蠶的細菌性敗血癥；程瑞春等［16］報告，通過對利用柞蠶繁蜂時蛹內(nèi)組織液化后呈粉紅色這一未知軟化病的典型癥狀進行病原細菌的研究，表明其病原菌為褪色沙雷菌。本次通過人工感染實驗及對感染死亡蟲體進行的感染菌復(fù)核檢驗，初步表明了褪色沙雷菌在養(yǎng)殖東亞飛蝗的原發(fā)病原學意義，其感染發(fā)病死亡的高峰期在接種后的24-72 h這與細菌感染的致病作用特征也是比較符合的；至于在實驗觀察期內(nèi)對照組東亞飛蝗的死亡，最可能的原因是與養(yǎng)殖環(huán)境的改變相關(guān)聯(lián)的，但也不能排除在實驗組中也有因這種情況出現(xiàn)的死亡。

從另外一個角度來看，目前國內(nèi)外對蝗災(zāi)的生物學防治研究與實驗應(yīng)用，主要包括綠僵菌（Metarhazium spp.）、蝗蟲微孢子蟲（Nosema locustae）等，尚存在難于克服的時效性、產(chǎn)業(yè)化及實際效果等方面問題［17-20］；在細菌方面，已先后有對產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、類產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp.）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等的研究，認為在對蝗蟲的生物防治領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，但還均未進入實際應(yīng)用階段［21-27］。綜合分析，褪色沙雷氏菌對人、養(yǎng)殖及野生動物并不具有發(fā)生流行病的病原學意義；如果從發(fā)病死亡養(yǎng)殖東亞飛蝗分離獲得的這種褪色沙雷氏菌，進一步研究確定在蝗蟲的致病作用與強度，則不排除可能成為對蝗災(zāi)進行生物學防治研究的直接或構(gòu)建基因工程菌的候選菌株。

4 結(jié)論

從病死蝗蟲中分離純化的細菌10株，通過回歸感染實驗驗證其病原性，利用表觀學特征觀察、生理生化特性鑒定及16S rRNA系統(tǒng)學發(fā)育分析鑒定是腸桿菌科沙雷氏菌屬中褪色沙雷氏菌。

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（責任編輯李楠）

The Identification and Analysis of Pathogenic Serratia marcescens from Locusta migratoria manilensis

Wu Nan Guo Yangliu Wang Xiaoshan Li Yanyun Lu Huipeng Chen Cuizhen Zhang Donglin Fang Hai
（Hebei Normal University of Science and Technology，Qinhuangdao 066000）

The effective isolation and identification of pathogen bacteria Serratia marcescens has a certain reference and application value for the control of infectious disease in culturing locusts caused by the S. marcescens. In addition， it will provide an insight for the research on biological control of plague of locust. From the dead Locusta migratoria manilensis from the infection， 10 strains of bacteria were isolated， and they were examined and analyzed with the apparent indications of taxonomy， 16S rRNA gene sequences and phylogenetic analysis， and artificial model of infection. Based on genetic and phenotypic information， the isolates were identified as S. marcescens which had high pathogenicity to cultured L. mingratoria manilensis. In conclusion， S. marcescens causes pathogenicity to L. mingratoria manilensis and it is a pathogenic bacterium in the culture of L. mingratoria manilensis， which lays a theoretical foundation for the biocontrol of locusts.

Locusta migratoria manilensis；Serratia marcescens；identification and analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.035

2015-04-15

吳楠，女，碩士研究生，研究方向：病原微生物；E-mail：huashengwunan@163.com

房海，男，教授，研究方向：病原微生物；E-mail：fanghaihb@163.com