曾婷　劉雅萌　劉永東

摘 要 重金屬污染對(duì)環(huán)境和人體健康已造成嚴(yán)重威脅，N-亞硝基二甲胺（NDMA）作為具有強(qiáng)致癌性的環(huán)境污染物也引起了廣泛的關(guān)注.本論文探討了重金屬離子Cd（Ⅱ）、Hg（Ⅱ）和Pb（Ⅱ）在模擬胃液中，對(duì)NDMA形成的影響；并運(yùn)用密度泛函理論（DFT）計(jì)算方法研究了重金屬離子的可能作用機(jī)理.實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)3種重金屬離子均能促進(jìn)NDMA的形成，而理論計(jì)算結(jié)果表明重金屬離子與二甲胺之間的相互作用強(qiáng)于與亞硝酸之間的相互作用，而且重金屬離子與二甲胺形成的中間體通過先失去氫質(zhì)子，再與亞硝酸作用可以生成NDMA.此反應(yīng)是一個(gè)放熱過程，而且反應(yīng)的能壘較低，由此推測(cè)重金屬離子很可能是通過與二甲胺作用而促進(jìn)NDMA的形成.

關(guān)鍵詞 重金屬離子；NDMA形成；促進(jìn)作用；密度泛函理論

中圖分類號(hào) O641 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2014）06-0042-05

Abstract Heavy metal ion contamination has caused severe threats to environment and human body. N-Nitrosodimethylamine（NDMA）， as a potent carcinogen， has drawn much attention. In the present study， the influence of heavy metal ions including Cd（Ⅱ）， Hg（Ⅱ）， and Pb（Ⅱ） on NDMA formation in simulated gastric fluid and the possible reaction mechanisms were investigated from both experimental and theoretical aspects. The experimental results indicate that NDMA formation can be promoted by above heavy metal ions. DFT calculations indicate that there are much stronger interaction of heavy metal ions with dimethylamine（DMA） than those of heavy meal ions with nitrite. Moreover， the intermediates of heavy metal ions with DMA can first release a proton， and then react with nitrous acid to form NDMA. This reaction is an exothermal process and its energy barrier is relatively low， from which it can be predicted that heavy metal ions are bound to react with DMA to facilitate the formation of NDMA.

Key words heavy metal ions； NDMA formation； promotion effect； DFT

重金屬污染物對(duì)環(huán)境以及人體造成了嚴(yán)重的威脅，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，比如中國(guó).重金屬對(duì)人體健康造成的威脅主要與鎘、汞、鉛的暴露相關(guān).鎘能毒害腎臟、骨骼系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)[1].汞高度危害人體健康，尤其是對(duì)胚胎早期的發(fā)育造成嚴(yán)重威脅[2].鉛是一個(gè)累積性的有毒物，能影響包括神經(jīng)系統(tǒng)，血液系統(tǒng)，胃腸道，心血管和腎臟等多種人體系統(tǒng).工業(yè)“三廢”和生活污水的排放嚴(yán)重污染了土壤和水體[3].重金屬通過土壤/水/空氣-糧食/蔬菜/牲畜-食物的途徑進(jìn)入人體[4].表1列舉了此3種重金屬在我國(guó)的不同體系中的限量值[5-6].

由于大部分的N-亞硝基化合物（NOC）是人類潛在的致癌物，因此引起了人們的廣泛關(guān)注[7].N-亞硝基二甲胺（NDMA）是NOC中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單，但致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一.國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將NDMA及其他3種NOC歸類為2A類致癌物[8].美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（U.S. EPA）公布，飲用水中0.7 ng·L-1的NDMA將會(huì)產(chǎn)生10-6的致癌風(fēng)險(xiǎn)[9].研究發(fā)現(xiàn)人體暴露于NDMA有外源性和內(nèi)源性兩種途徑，而且其中在人體內(nèi)胃、腸和膀胱等器官形成的內(nèi)源性途徑約占總暴露的60%以上[10].因此，有關(guān)內(nèi)源性NDMA形成的研究已成為保護(hù)人體健康的重要研究?jī)?nèi)容和被關(guān)注的領(lǐng)域.

如上所述，重金屬和NDMA都對(duì)人體健康具有很大威脅.尤其是發(fā)展中國(guó)家糧食、蔬菜中重金屬的濃度常常高于限量值，因此，研究重金屬對(duì)體內(nèi)NDMA形成的影響很有必要.但迄今為止，重金屬離子對(duì)內(nèi)源性NDMA形成的研究非常缺乏[11].因此，本研究著重對(duì)3種重金屬離子對(duì)模擬胃液中NDMA形成的影響及其作用機(jī)理進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

NDMA及NDMA-d6標(biāo)準(zhǔn)溶液，由Dr. Ehrenstorfer GmbH提供；Cd（Ⅱ）、Hg（Ⅱ）和Pb（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)溶液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；二氯甲烷、正己烷、甲醇為色譜純，天津福晨；二甲胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉、氯化鈉為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；胃蛋白酶，Sigma公司；水由Milli Q超純水機(jī)制備.

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）：Trace DSQ （Thermo）；色譜柱：DB-1701（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NDMA檢測(cè)的GC/MS條件[12] 進(jìn)樣口溫度：200 ℃；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：230 ℃；載氣流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣模式：不分流；程序升溫方法：初始溫度為45 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1速率升高至200 ℃，保持5 min.溶劑延遲時(shí)間：3.50 min；Full Scan掃描范圍：20～300；SIM碎片離子選擇：74，42，28，80；進(jìn)樣量：1 μL；EI源電子轟擊能量：70 eV.

1.2.2 NDMA形成的反應(yīng)過程 空白組：向試管中加入6 mL pH 2.0的鹽酸，濃度為20 g·L-1的氯化鈉溶液1 mL，濃度為32 g·L-1的胃蛋白酶溶液1 mL，50 mmol·L-1的DMA溶液1 mL，50 mmol·L-1的亞硝酸鈉溶液1 mL，用4 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)溶液至pH 2；實(shí)驗(yàn)組：向試管中依次加入5 mL pH 2.0的鹽酸，濃度為20 g·L-1的氯化鈉溶液1 mL，濃度為32 g·L-1的胃蛋白酶溶液1 mL，50 mmol·L-1的DMA溶液1 mL，50 mmol·L-1的亞硝酸鈉溶液1 mL，重金屬溶液1 mL，用4 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.將空白體系和實(shí)驗(yàn)體系置于37 ℃水浴中反應(yīng)2 h.

1.2.3 樣品處理 反應(yīng)結(jié)束后，取出樣品，加入內(nèi)標(biāo).將其上樣于預(yù)先用甲醇活化好的固相萃取柱，上樣完畢后，徹底抽干；用正己烷淋洗一遍；最后用二氯甲烷洗脫并定容至3 mL，待測(cè).

1.3 理論計(jì)算方法

本文運(yùn)用密度泛函理論（DFT）， 在B3LYP/6-311+G（d，p）/LANL2DZ水平上[13-15]分別對(duì)重金屬離子與亞硝酸以及重金屬離子與DMA反應(yīng)中的反應(yīng)物、中間體、過渡態(tài)和產(chǎn)物進(jìn)行了幾何結(jié)構(gòu)的全優(yōu)化，同時(shí)在此水平上計(jì)算了各駐點(diǎn)的振動(dòng)頻率，確認(rèn)所得到的構(gòu)型是無(wú)虛頻的穩(wěn)定點(diǎn)或有且僅有一個(gè)虛頻的過渡態(tài)；并通過內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)（IRC）的計(jì)算，確定了過渡態(tài)是連接反應(yīng)物和產(chǎn)物的最低能量途徑.本文所有計(jì)算均利用Gaussian A03[16]程序完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 重金屬離子對(duì)NDMA形成的影響

對(duì)不同濃度的重金屬離子（0.005、0.01、0.1和1.0 mg·L-1）對(duì)模擬胃液中5 mmol·L-1二甲胺和5 mmol·L-1亞硝酸鈉形成NDMA的影響進(jìn)行了研究，所得數(shù)據(jù)如表2和圖1所示.

從表2可以看出，當(dāng)體系中加入Cd（Ⅱ）、Hg（Ⅱ）和Pb（Ⅱ）溶液時(shí)，NDMA的生成量較空白實(shí)驗(yàn)有一定的增加，這表明上述3種重金屬離子均對(duì)NDMA的形成具有促進(jìn)作用.當(dāng)Cd（Ⅱ）濃度為0.005、0.01、0.1和1.0 mg·L-1時(shí)，NDMA的促進(jìn)率分別為3.8%、8.0%、12.7%和19.9%，表明隨Cd（Ⅱ）濃度的增加，其對(duì)NDMA的促進(jìn)率也明顯增大，由此可見Cd（Ⅱ）的濃度與其對(duì)NDMA促進(jìn)率間存在著正相關(guān).

如圖1所示，Hg（Ⅱ）與Cd（Ⅱ）呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，Hg（Ⅱ）的濃度同樣與NDMA形成的促進(jìn)率呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系.1.0 mg·L-1的Hg（Ⅱ）促進(jìn)NDMA形成的促進(jìn)率最大，為27.90%.比較相同濃度下Cd（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）對(duì)NDMA形成的促進(jìn)率發(fā)現(xiàn)，Hg（Ⅱ）的促進(jìn)率比Cd的高.而Pb（Ⅱ）與Cd（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）不同，隨著體系中Pb（Ⅱ）濃度的升高，NDMA形成的促進(jìn)率呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì).當(dāng)Pb（Ⅱ）的濃度低至0005 mg·L-1時(shí)，促進(jìn)率達(dá)到最大值13.8%.上述結(jié)果表明最大促進(jìn)率的順序?yàn)镠g（Ⅱ）>Cd（Ⅱ）>Pb（Ⅱ），然而當(dāng)濃度最低時(shí)，3種重金屬離子的促進(jìn)率順序?yàn)镻b（Ⅱ）>Hg（Ⅱ）>Cd（Ⅱ）.但其中最大促進(jìn)率（27.9%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于Schreiber[11]等報(bào)道的Cu（Ⅱ）對(duì)NHCl2和DMA反應(yīng)體系中NDMA形成的促進(jìn)率（80%）.

2.2 重金屬離子與DMA結(jié)合產(chǎn)物的理論研究

本文運(yùn)用密度泛函理論（DFT）對(duì)重金屬離子與DMA相互作用的產(chǎn)物M-DMA及重金屬離子與亞硝酸相互作用的產(chǎn)物M-HNO2進(jìn)行了研究.Herrera[17]等人報(bào)道金屬離子Cu（Ⅱ） 與Zn（Ⅱ）能與胺分子上氮原子發(fā)生配位作用，結(jié)合形成金屬離子與胺分子的四配位體，Kecht[18]認(rèn)為金屬離子與胺分子能形成穩(wěn)定的平面正方形和四面體復(fù)合物.

2.3 重金屬離子與DMA/HNO2結(jié)合產(chǎn)物結(jié)合能的理論研究

為探討實(shí)驗(yàn)中重金屬離子的促進(jìn)作用，首先需要清楚重金屬離子是先與DMA還是與HNO2作用.為此，作者研究了重金屬離子和DMA分子及亞硝酸分子之間的相互作用.M-DMA和M-HNO2中間體的反應(yīng)能量和結(jié)合能列于表3.考慮到實(shí)際溶液體系中多種離子的存在及離子氛的作用，真實(shí)的金屬離子的鍵能可能會(huì)遠(yuǎn)低于計(jì)算值.

由表3可知，重金屬離子與DMA和亞硝酸之間相互作用的反應(yīng)均為放熱過程.重金屬Cd（Ⅱ）， Hg（Ⅱ）， Pb（Ⅱ）與DMA分子配位生成的MNH（CH3）2（Ⅱ） 中間體結(jié)合能分別為500.4， 569.0和417.1 kJ·mol-1，而重金屬與亞硝酸生成的M（ONOH）中間體結(jié)合能分別為284.5， 309.2 和248.5 kJ·mol-1.這清楚地表明，M-DMA的焓變和自由能變均比M-NO2相應(yīng)的焓變和自由能變要低，而重金屬離子與DMA中間體結(jié)合能比重金屬與亞硝酸中間體結(jié)合能高出約160 ～ 250 kJ·mol-1.

可見，重金屬離子與DMA之間相互作用遠(yuǎn)比與亞硝酸的作用要強(qiáng)，而且M-DMA中間體的穩(wěn)定性也遠(yuǎn)比M-HNO2中間體強(qiáng).這表明在熱力學(xué)上，重金屬離子更容易與DMA反應(yīng)而不是亞硝酸.由此，可以推測(cè)重金屬離子很可能是通過先與二甲胺作用，形成反應(yīng)活性比二甲胺更強(qiáng)的中間體，更易發(fā)生亞硝化反應(yīng)，從而促進(jìn)NDMA的形成.

2.4 重金屬離子與DMA結(jié)合產(chǎn)物與亞硝酸反應(yīng)生成NDMA的理論研究

基于前面的研究，發(fā)現(xiàn)重金屬離子更容易與DMA結(jié)合生成穩(wěn)定的中間體，因此，繼續(xù)研究此中間體如何與亞硝酸反應(yīng)生成NDMA.研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子與DMA結(jié)合的中間體M-NH（CH3）2可以通過先失去一個(gè)氫質(zhì)子后與亞硝酸反應(yīng).反應(yīng)中的反應(yīng)物配合物（CP1）、過渡態(tài)（TS1）和產(chǎn)物配合物（TM1）的結(jié)構(gòu)如圖2所示.MN（CH3）2+與亞硝酸反應(yīng)過程中的焓變、自由能變和反應(yīng)能壘的數(shù)據(jù)列于表4中.

從圖2中可看出，反應(yīng)物配合物（CP1）中亞硝酸中的OH基團(tuán)通過慢慢接近重金屬離子，與其發(fā)生鍵合形成M-OH鍵，ON基團(tuán)與MOH中的O原子相互作用，形成如TS1所示的過渡態(tài).此過渡態(tài)中的ON基團(tuán)通過遷移，與M-N（CH3）2中的N原子發(fā)生相互作用，進(jìn)而鍵合形成NDMA，與此同時(shí)M-N鍵斷裂，導(dǎo)致M（OH）+離子生成.

如表4所示，對(duì)于Cd，Pb和Hg 3種重金屬離子的配合物MN（CH3）2+都能與亞硝酸反應(yīng)生成NDMA，而且反應(yīng)都是放熱過程，反應(yīng)熱分別為-61.06、-70.72和-34.00 kJ·mol-1，這些反應(yīng)的自由能變分別為-56.58，-57.46和-26.18 kJ·mol-1，可見此反應(yīng)在熱力學(xué)上可自發(fā)進(jìn)行.根據(jù)過渡態(tài)理論，Cd，Pb和Hg 3種重金屬離子的絡(luò)合物與亞硝酸反應(yīng)的能壘分別為21.24，14.55和41.40 kJ·mol-1，而反應(yīng)的自由能活化能為30.44，24.42和53.95 kJ·mol-1.作者課題組以前的計(jì)算結(jié)果[19]表明，DMA直接與亞硝酸反應(yīng)的能壘高于130 kJ·mol-1，而本文的計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重金屬參與后的這些反應(yīng)的能壘和自由能活化能都明顯降低.可見，重金屬離子與DMA結(jié)合的配合物較容易與亞硝酸反應(yīng)生成NDMA.因此，可以推測(cè)重金屬離子很可能是通過與DMA作用，生成活性更強(qiáng)的中間體，更易發(fā)生亞硝化反應(yīng)，從而促進(jìn)NDMA的形成.

3 結(jié)論

本文研究了重金屬離子Cd（Ⅱ），Hg（Ⅱ）和Pb（Ⅱ）在模擬胃液中對(duì)NDMA形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)3種重金屬離子均能促進(jìn)NDMA的形成，其最大促進(jìn)率的順序?yàn)镠g（Ⅱ）>Cd（Ⅱ）>Pb（Ⅱ）；但當(dāng)濃度為0.005 mg·L-1時(shí)，Pb（Ⅱ） 表現(xiàn)出最大的促進(jìn)率（13.8%）.運(yùn)用DFT方法研究了重金屬離子與DMA和亞硝酸的作用，結(jié)果表明重金屬離子與DMA之間存在比亞硝酸更強(qiáng)烈的相互作用，M-DMA中間體的穩(wěn)定性也遠(yuǎn)強(qiáng)于M-HNO2中間體.DFT的深入研究發(fā)現(xiàn)重金屬離子與DMA形成的配合物，較容易與亞硝酸反應(yīng)，反應(yīng)的活化能低于42 kJ·mol-1，且為放熱反應(yīng).由此可以推測(cè)，金屬離子很可能是通過先與二甲胺作用，形成反應(yīng)活性比二甲胺更強(qiáng)的中間體，更易發(fā)生亞硝化反應(yīng)，從而促進(jìn)了NDMA的形成.

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（編輯 楊春明）