王　燕，胡　偉，郭子維，孫凌云，陳智勇

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210008)

抗氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-transfer RNA synthetase，ARS)抗體是多發(fā)性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)患者中最常見的一類特異性自身抗體[1]，患者常常出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、雷諾現(xiàn)象、技工手和間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)，被稱為抗合成酶抗體綜合征。迄今為止共發(fā)現(xiàn)8種抗ARS抗體，分別針對(duì)組氨酸(Jo-1)、蘇氨酸(PL-7)、丙氨酸(PL-12)、甘氨酸(EJ)、異亮氨酸(OJ)、門冬氨酸(KS)、酪氨酸(Ha)和苯丙氨酸(Zo)的氨?；D(zhuǎn)移酶[2]，其中抗Jo-1抗體最為常見，而抗Ha及抗Zo抗體最為罕見。由于檢測(cè)方法的限制，目前臨床常規(guī)只能檢測(cè)其中的1～2種抗體，我國人群ARS抗體譜中各抗體的陽性率尚不明確。本研究采用經(jīng)典核酸免疫沉淀法對(duì)漢族PM/DM患者的抗ARS抗體譜進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)抗Jo-1陽性患者與非Jo-1抗ARS抗體陽性患者的臨床特點(diǎn)進(jìn)行比較。

對(duì)象與方法

一般資料

收集2011年3月至2012年12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的145例PM/DM患者血清，并收集其臨床資料。所有患者均符合Bohan和Peter關(guān)于PM/DM的確診或臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，或Sonthemier[3]和Sato等[4]關(guān)于臨床無肌病型皮肌炎(clinical amyopathic dermatomyositis，CADM)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于臨床表現(xiàn)符合CADM，但因ILD致呼吸衰竭并于6個(gè)月內(nèi)死亡者仍診斷為CADM。145例患者中8例合并腫瘤，但不包括合并其他結(jié)締組織病的患者。ILD根據(jù)肺部高分辨CT診斷。所有患者均為漢族。

該研究得到南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部患者均知情同意。

方法

采用核酸免疫沉淀法檢測(cè)抗ARS抗體[5]。分別采用抗Jo-1、抗PL-7、抗PL-12、抗EJ、抗OJ、抗KS抗體陽性血清和正常人血清作為陽性和陰性對(duì)照。

主要步驟簡(jiǎn)述如下：(1)抗原制備：培養(yǎng)并回收Hela細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液離心后取上清液作為抗原備用。(2)免疫沉淀反應(yīng)：取10 μl患者血清、2 mg蛋白A-瓊脂糖珠和步驟(1)所得的抗原液混合，進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。(3)核酸提取：瓊脂糖珠經(jīng)酚∶氯仿∶異戊醇混合液(25∶24∶1)充分混合，加入100%乙醇待RNA析出，抽真空使所得RNA干燥。(4)核酸電泳：上述RNA中加入IPP標(biāo)本緩沖液，經(jīng)8%聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳3 h。凝膠采用銀染色試劑盒進(jìn)行染色(Bio-Rad公司)，染色方法按試劑盒說明書操作。染色后對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，風(fēng)干保存。所得結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)陽性血清電泳條帶進(jìn)行比對(duì)和判讀(圖1)。臨床上通常使用酶聯(lián)免疫吸附法和間接免疫熒光法對(duì)抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)和抗Jo-1抗體進(jìn)行檢測(cè)，本研究對(duì)這2種方法和免疫沉淀法結(jié)果進(jìn)行比較。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)[6]；采用免疫沉淀-蛋白印跡法檢測(cè)抗核基質(zhì)蛋白2(nuclear matrix protein 2，NXP2)、抗轉(zhuǎn)錄中介因子1γ(transcriptional intermediary factor，TIF1γ)、抗信號(hào)識(shí)別顆粒(signal recognition particle，SRP)、抗小泛素樣修飾物活化酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme，SAE)、抗Mi2抗體[7]。間接免疫熒光法檢測(cè)ANA的試劑盒購自德國歐蒙公司，抗Jo-1抗體檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購自深圳亞輝龍公司。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

漢族人群抗ARS抗體譜分布

145例PM/DM患者中，40例(27.6%)抗ARS抗體陽性。其中，抗Jo-1抗體陽性者24例(24/40，60%)，非Jo-1抗ARS陽性者16例(16/40，40%)。16例非Jo-1抗ARS陽性者中抗EJ抗體陽性者7例(7/40，17.5%)，抗OJ抗體陽性者5例(5/40，12.5%)，抗KS陽性者3例(3/40，7.5%)，抗PL-12抗體陽性者1例(1/40，2.5%)。所有抗ARS陽性患者抗PL-7、抗Ha、抗Zo、抗MDA5、抗NXP2、抗TIF1γ、抗SRP、抗SAE、抗Mi2抗體均陰性。

核酸免疫沉淀法與其他方法檢測(cè)抗ARS抗體比較

在免疫沉淀法檢測(cè)的抗Jo-1、抗EJ、抗OJ、抗KS和抗PL-12陽性患者中，間接免疫熒光法ANA陽性者分別為18、5、3、2和1例(共29例)，其敏感性為72.5%(29/40)。免疫沉淀法抗Jo-1陽性患者中14例酶聯(lián)免疫吸附法抗Jo-1陽性，酶聯(lián)免疫吸附法敏感性為58.3%(14/24)。

漢族抗ARS抗體陽性患者臨床特征

抗Jo-1抗體陽性患者診斷為CADM、DM和PM者分別為0例、3例和21例，非Jo-1抗ARS抗體陽性患者診斷為CADM、DM和PM者分別為2例、7例和7例。

抗Jo-1抗體陽性和非Jo-1抗ARS陽性患者比較發(fā)現(xiàn)，2組患者性別和年齡分布類似。起病時(shí)發(fā)熱、雷諾現(xiàn)象、關(guān)節(jié)痛、技工手、ILD、吞咽困難發(fā)生率在抗Jo-1抗體組(分別為54.2%、16.7%、25.0%、33.3%、91.7%和4.2%)和非Jo-1抗ARS組(分別為43.8%、31.3%、37.5%、25.0%、100.0%和18.8%)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與非 Jo-1 抗ARS陽性組(7/16，43.8%)相比，抗Jo-1陽性組(21/24，87.5%)PM患者較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.75，P=0.003)。與非Jo-1合成酶抗體陽性患者相比，抗Jo-1抗體陽性患者肌酸激酶水平偏高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(861±820) U/Lvs.(3 041±4 351) U/L，P>0.05](表1)。

討　　論

抗Jo-1抗體最初由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8]，隨后抗PL-7、抗PL-12、抗OJ、抗EJ等抗體被相繼發(fā)現(xiàn)，這些抗體的靶抗原均為氨基酰tRNA合成酶，故統(tǒng)稱抗ARS抗體。本研究使用核酸免疫沉淀法對(duì)漢族PM/DM患者的抗ARS抗體進(jìn)行檢測(cè)，該方法為抗ARS抗體檢測(cè)的經(jīng)典方法，根據(jù)電泳所得的條帶位置和組合不同可檢測(cè)出所有抗合成酶抗體。雖然本研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中未包含抗Ha和抗Zo抗體這2種陽性血清，但是由于未發(fā)現(xiàn)與所用6種標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照不同的條帶組合，可確定在所測(cè)標(biāo)本中不含有抗Ha和抗Zo抗體。事實(shí)上，抗Ha和抗Zo抗體尚未被其發(fā)現(xiàn)者以外的研究者所證實(shí)，在白種人[9]和日本人[5]的大規(guī)模研究中亦未發(fā)現(xiàn)這2種抗體。由此，筆者初步得出以下結(jié)論：在漢族人PM/DM患者中，抗ARS抗體總陽性率約為27.6%，其中抗Jo-1抗體最多，占全部抗ARS抗體的60%；其他抗ARS包括抗EJ、抗OJ、抗KS和抗PL-12抗體，共占全部抗ARS抗體的40%；而抗Ha和抗Zo抗體在漢族人群中可能非常罕見。Hamaguchi等[5]和Aggarwal等[9]的研究是現(xiàn)有文獻(xiàn)中患者數(shù)最多且有完整抗ARS譜數(shù)據(jù)的研究，分別來自于日本人和白種人。與這些研究相比，漢族人非Jo-1抗ARS抗體占全部抗ARS抗體的比例與白種人類似(分別為40%和39.6%)，但低于日本人群(分別為40%和64.2%)?？筆L-7抗體在日本人和白種人中并不少見，分別占抗ARS的17.6%和12.4%，但本研究中未發(fā)現(xiàn)抗PL-7陽性患者。謝瑤等[10]曾使用免疫印跡法對(duì)31例PM/DM患者進(jìn)行了檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)抗Jo-1陽性患者9例(29%，9/31)，抗PL-7和抗PL-12陽性患者各1例(3%，1/31)，但由于該方法未能對(duì)所有抗ARS抗體進(jìn)行檢測(cè)，因而不宜與本研究結(jié)果進(jìn)行直接比較。造成結(jié)果不同的原因可能是檢測(cè)方法不同或患者來自于不同地區(qū)。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，抗ARS等肌炎特異性自身抗體與人類白細(xì)胞抗原基因多態(tài)性[11]，以及某些環(huán)境因素如病毒感染、吸煙等有關(guān)[12-13]。因此，不同種族和地區(qū)人群抗ARS譜的不同可能和這些遺傳因素和/或環(huán)境因素有關(guān)，但這還有待進(jìn)一步研究來證實(shí)。

表1　抗Jo-1抗體與非Jo-1抗ARS抗體陽性患者臨床特征比較

*與非Jo-1抗ARS陽性組比較，χ2=8.75，P=0.003

臨床常用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗Jo-1抗體。在本組核酸免疫沉淀法證實(shí)的24例抗Jo-1陽性患者中，酶聯(lián)免疫吸附法陽性者僅為14例，說明該方法敏感性僅為58.3%(14/24)，遠(yuǎn)不及核酸免疫沉淀法。理論上，核酸免疫沉淀法抗ARS陽性者間接免疫熒光法檢測(cè)ANA亦為陽性，但由于抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較低或細(xì)胞固定時(shí)抗原丟失，部分抗ARS陽性血清在間接免疫熒光法檢測(cè)ANA時(shí)呈陰性反應(yīng)。本研究40例抗ARS陽性患者中，僅29例間接免疫熒光法ANA陽性，其敏感性為72.5%(29/40)。本結(jié)果提示，非Jo-1抗ARS抗體在漢族PM/DM患者中并不少見，在臨床表現(xiàn)呈典型抗合成酶抗體綜合征的患者，在酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗Jo-1抗體陰性和(或)間接免疫熒光法ANA陰性情況下，仍需積極考慮抗合成酶抗體綜合征的診斷。

在本研究中，抗Jo-1抗體陽性患者和非Jo-1抗ARS抗體陽性患者在性別、年齡和發(fā)熱、雷諾現(xiàn)象、關(guān)節(jié)痛、技工手、ILD、吞咽困難等發(fā)生率和CK水平方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然抗ARS抗體陽性患者一般具有上述共同表現(xiàn)，但也有研究認(rèn)為不同抗ARS抗體可能對(duì)應(yīng)不同臨床特征。例如，Labirua-Iturburu等[14]對(duì)18例歐洲抗PL-7陽性患者的研究發(fā)現(xiàn)，除上述表現(xiàn)外，該抗體還可能和心包炎有關(guān)；Yamasaki等[15]對(duì)日本患者的分析發(fā)現(xiàn)，與抗Jo-1抗體陽性患者相比，抗PL-7患者的肌肉受累較輕；Hamaguchi等[5]發(fā)現(xiàn)，抗KS和抗OJ患者起病時(shí)大多只有間質(zhì)性肺炎，隨病情進(jìn)展逐漸出現(xiàn)肌炎表現(xiàn)。最近，Aggarwal等[9]通過大規(guī)模人群研究發(fā)現(xiàn)，非Jo-1合成酶抗體陽性患者的生存時(shí)間顯著低于抗Jo-1抗體陽性患者。非Jo-1抗ARS抗體臨床常常難以檢測(cè)，因此，非Jo-1合成酶抗體陽性患者即使伴有ILD，但由于無抗體結(jié)果支持，臨床仍難以明確診斷其為抗ARS綜合征，從而導(dǎo)致診斷和治療延遲，筆者認(rèn)為這種延遲可能是患者生存時(shí)間縮短的原因之一[9]。漢族患者是否也具有以上這些特征，還需進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行研究。國外部分資料顯示，抗Jo-1陽性患者以DM多見[5，16]，而本研究患者中抗Jo-1陽性患者多數(shù)并無DM特異性皮疹[向陽疹和(或)Gottron疹/征]，因而診斷為PM。部分患者雖然有技工手、披肩征或V形征等皮膚表現(xiàn)，但根據(jù)Bohan和Peter的標(biāo)準(zhǔn)，此類患者仍被診斷為PM。Doblouq等[16]開展研究為基于人群的調(diào)查性研究，Hamaguchi等[5]研究中的患者來自風(fēng)濕科、皮膚科和呼吸科等多個(gè)學(xué)科；而本研究患者均來自于風(fēng)濕免疫科，患者來源不同導(dǎo)致DM特異性皮疹患者比例不同，可能是造成這種差異的主要原因(就診于皮膚科的患者皮疹比例可能更大)。

本研究的不足之處：樣本量相對(duì)較小，隨訪時(shí)間相對(duì)較短且部分患者失訪，未能對(duì)各抗ARS抗體臨床特點(diǎn)及結(jié)局等進(jìn)行詳細(xì)比較；患者均來自江蘇地區(qū)，尚不足以代表全部漢族人群，因而應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行謹(jǐn)慎解釋等。

綜上所述，本研究首次對(duì)漢族PM/DM的抗ARS譜進(jìn)行了全面檢測(cè)，結(jié)果顯示非Jo-1抗ARS抗體在漢族PM/DM患者中并不少見，其臨床表現(xiàn)與抗Jo-1陽性患者類似，對(duì)臨床表現(xiàn)符合抗合成酶抗體綜合征但常規(guī)檢測(cè)抗Jo-1抗體陰性患者，應(yīng)考慮到非Jo-1抗ARS抗體陽性的可能。

致謝：抗Jo-1、抗PL-7、抗PL-12、抗EJ、抗OJ、抗KS抗體陽性血清由日本慶應(yīng)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科Kuwana教授提供。

圖1核酸免疫沉淀法檢測(cè)抗合成酶抗體

Fig1Anti-synthetase antibodies detected by RNA-immunoprecipitation

1～6分別為抗PL-12、抗OJ、抗EJ、抗KS、抗PL-7和抗Jo-1抗體陽性標(biāo)準(zhǔn)血清；8：抗KS；15：抗OJ；38：抗Jo-1；47：抗EJ；49：陰性；57：抗EJ；83：抗PL-12；95、100：抗EJ；*6、57和95同時(shí)伴有抗SSA抗體陽性

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