張翼 廖浩 趙秀云

摘要：為從中國(guó)江河、海水等水體中篩選油脂含量較高的微藻，采集了青島海水、武漢南湖水的水樣，分離了12株微藻。對(duì)微藻的油脂含量進(jìn)行了測(cè)定，其中油脂含量最高的微藻為H2-1，油脂含量達(dá)到56.25%細(xì)胞干重，其次是BQ6，油脂含量為31.43%。BQ1、BQ2、BQ4、BQ6油脂含量也較高，達(dá)29%左右。PCR擴(kuò)增獲得微藻18S rDNA的部分片段，序列測(cè)定后，進(jìn)行BLAST同源性分析。結(jié)果表明，QS1、QS2、QS3、BQ1、BQ2、BQ3、BQ4、BQ5、BQ6、H1-1、H2-2均屬于小球藻屬（Chlorella spp.），H2-1屬于膠網(wǎng)藻屬（Dictyosphaerium sp.）。該研究將為中國(guó)生物能源的生產(chǎn)和開發(fā)提供優(yōu)良的藻種資源。

關(guān)鍵詞：微藻；油脂；鑒定；小球藻；生物能源

中圖分類號(hào)：S968.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0574-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.016

Isolation， Screening and Identification of Oil-rich Microalgae

ZHANG Yi，LIAO Hao，ZHAO Xiu-yun

（College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： In order to isolate oil-rich microalgae from river and sea， the water samples were collected from Qingdao sea and South lake in Wuhan city. 12 strains of microalgae were isolated. The results showed that the oil content of microalgae H2-1 was the highest with 36.25 percentage of cell dry weight. The oil content of microalgae BQ6 was 31.43 percentage. The oil contents of microalgae BQ1、BQ2、BQ4、BQ6 was as high as 29 percentage. Partial fragment of microalgae 18S rDNA was obtained by PCR amplification and sequenced. The results of BLAST analysis showed that microalgae QS1， QS2， QS3， BQ1， BQ2， BQ3， BQ4， BQ5， BQ6， H1-1 and H2-2 was belonged to Chlorella spp. H2-1 was belonged to Dictyosphaerium sp. It will provide good algae for the development of bio-energy in China.

Key words： microalgae； oil； identification； Chlorella； Bio-energy

生物能源是由活的生物體或其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的。第一代生物能源來(lái)自于玉米、大豆、甘蔗。第二代生物能源來(lái)源于纖維素類物質(zhì)，木材廢料如鋸末，農(nóng)業(yè)廢料如玉米稈、小麥秸稈、快速生長(zhǎng)的草和木材等。第三代生物能源來(lái)自于藻類（Algae）、藍(lán)藻。藻類種類很多，包括單細(xì)胞的微藻、多細(xì)胞的大型藻類，存在于多種水體中，包括淡水、海水。微藻（包括綠藻、硅藻、藍(lán)藻等）含有高水平的脂類，是發(fā)展生物能源的極佳生物來(lái)源。某些藻類含40%脂肪酸，這些脂肪酸能被提取并轉(zhuǎn)化為生物燃料。目前已發(fā)現(xiàn)多種能作為生物能源的藻類，包括Neochloris oleoabundans、Scenedesmus dimorphus、Euglena gracilis、Phaeodactylum tricornutum、Pleurochrysis carterae、

Tetraselmis chui、Isochrysis galbana、Botryococcus braunii、Dunaliella tertiolecta、Chlamydomonas reinhardtii[1，2]。與陸地植物相比，藻類每單位面積可產(chǎn)生8～24倍生物柴油，使藻類位于生物柴油的首要地位。每公頃藻類可生產(chǎn)20 000～100 000 L油脂。而玉米每公頃僅產(chǎn)172 L油脂，大豆每公頃產(chǎn)446 L油脂，花生每公頃可產(chǎn)1 059 L油脂?？梢?，藻類與目前種植的植物相比，其單位面積可產(chǎn)20倍及更多的油脂。且藻類生長(zhǎng)迅速，某些藻類在一天中能繁殖1～3代。微藻具有的這些優(yōu)點(diǎn)，使其受到科研工作者的青睞。美國(guó)通過(guò)基因工程獲得的小環(huán)藻，在實(shí)驗(yàn)室條件下，其脂質(zhì)含量增加到占干重的60%以上，戶外生產(chǎn)可達(dá)到40%以上[3-5]。

中國(guó)有著豐富的藻類資源，微藻無(wú)疑是制備生物柴油原料的優(yōu)良替代品，具有廣闊的開發(fā)前景。微藻熱解所得的燃油熱值高達(dá)33 MJ/kg。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻，并優(yōu)化其培養(yǎng)條件后，可獲得57.9%的燃油，是自養(yǎng)培養(yǎng)小球藻所產(chǎn)生燃油的3.4倍[6]。

然而，從藻類生產(chǎn)油脂仍處在實(shí)驗(yàn)室階段，或者田間試驗(yàn)階段，主要是因?yàn)樵孱愑椭膶?shí)際產(chǎn)量要比理論值低90%～95%，使得藻類生物油的生產(chǎn)成本非常高昂。本研究對(duì)中國(guó)水域中微藻進(jìn)行篩選，尋找富油藻類，通過(guò)研究其生長(zhǎng)特性、脂肪酸成分，尋找適合作為生物柴油原料的藻類。

1 材料與方法

1.1 藻種

微藻由本實(shí)驗(yàn)室從青島海水、武漢南湖水中篩選獲得，共計(jì)有12株。

1.2 培養(yǎng)基

從海水中篩選微藻采用L1海水培養(yǎng)基培養(yǎng)[7]，從南湖水篩選的微藻采用BG11和TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)[8]。

1.3 微藻的培養(yǎng)

從采集的水樣中分離微藻，采用藻類培養(yǎng)用的人工培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在光照度3 000 l x，光暗比為12 h∶12 h，（25±1） ℃溫度條件下培養(yǎng)。每天搖動(dòng) 2～3次，15 d后離心，收集藻泥，真空冷凍干燥，藻粉于 -20 ℃保存?zhèn)溆?。采用超聲波破碎處理?xì)胞以提取油脂。

1.4 油脂含量的測(cè)定

油脂的提取參照Bligh等[9]的方法：在離心管中加入一定重量的（W）干藻粉、氯仿-甲醇（2∶1）混勻，于25 ℃放置24 h。渦旋 2 min，于3 000 r/min離心 10 min。在上清液中加入氯仿-甲醇混合液（2∶1），渦旋，于3 000 r/min離心 10 min。收集上清液，在70 ℃烘箱中烘干至恒重（W1）。

油脂含量=W1/W×100%

1.5 微藻的分類鑒定

對(duì)分離的富油微藻進(jìn)行形態(tài)鑒定和分子鑒定。顯微鏡觀察微藻的細(xì)胞形態(tài)。用CTAB 法提取微藻細(xì)胞的DNA[10]。取200 mg培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的微藻樣品置于1.5 mL的離心管中，加入600 μL CTAB緩沖液（2% CTAB，100 mmol/L Tris·HCl，pH 8.0，1.4 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，2%巰基乙醇），混勻，于65 ℃水浴保溫1 h。取出后加等體積PCI提取液（苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25∶24∶1），混勻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入2倍體積無(wú)水乙醇，室溫下放置10 min，沉淀DNA。4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次。晾干，將DNA溶解于20 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris·HCl， 1 mmol/L EDTA）中。

以提取的微藻基因組DNA為模板，參照Timmins等[11]的方法設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增微藻18S rDNA序 列。采用的引物序列為：F 5′-GAAGTCGTAACAAGGTTTCC-3′；R 5′-TCCTGGTTAGTTTCTTTTC

C-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性 5 min；95 ℃變性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR 反應(yīng)體積為 50 μL，其中包括DNA 模板 100 ng、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL（2U）、引物（10 μmol/L） 各 2 μL、 dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、10 ×PCR Buffer 5.0 μL、 MgCl2（25 mmol/L） 3.0 μL 和 ddH2O 31.6 μL 。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的 DNA 片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)定序列后，在 NCBI網(wǎng)站上（http：//www.ncbi.nih.gov）用 Blast進(jìn)行同源分析。并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.6 繪制生長(zhǎng)曲線

培養(yǎng)微藻，每隔12 h取微藻培養(yǎng)液。以空白培養(yǎng)液為參照，測(cè)定藻液在750 nm的吸光度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制微藻的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻的分離

分別從青島海水、南湖水采集水樣，共分離到12株微藻。所得到的藻株生長(zhǎng)速度較快，一般生長(zhǎng)3 d即達(dá)到穩(wěn)定期。對(duì)微藻BQ5和BQ6的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。由圖1可知，BQ6生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)72 h吸光度達(dá)到最高，之后下降。BQ6培養(yǎng)48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 微藻的油脂含量

對(duì)微藻的油脂含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1。在光照培養(yǎng)箱28 ℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定期收集藻體，測(cè)定油脂含量。其中油脂含量最高的微藻為H2-1，油脂含量達(dá)到56.25%細(xì)胞干重。其次是BQ5，油脂含量為31.43%。此外，BQ1、BQ2、BQ4、BQ6油脂含量較高，在29%左右。由于H2-1的生物量較少，生長(zhǎng)時(shí)間比較長(zhǎng)，在相同的培養(yǎng)條件下只得到0.16 g干重的藻體，綜合微藻BQ5，BQ6的生長(zhǎng)曲線所以選擇BQ6作為遺傳改造的目標(biāo)藻株。小球藻與已有文獻(xiàn)所報(bào)道的小球藻的油脂含量在 15%～55% 范圍內(nèi)的研究結(jié)果較一致。

2.3 微藻的分子鑒定

由圖2可知，提取微藻總DNA，利用特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得微藻18S rDNA片段，大小約750 bp。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖3可知，BQ1與Chlorella sorokiniana 18S rRNA 基因同源性為90%。BQ2與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。BQ3與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。BQ5與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。BQ6與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。H2-2與Chlorella sp. CCAP 260/11 18S ribosomal RNA基因同源性為96%。QS1與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。QS2與C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性為90%。H2-1與Dictyosphaerium ehrenbergianum strain 18S rRNA基因同源性為87%。

綜合序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、顯微形態(tài)等結(jié)果，初步確定QS1、QS2、QS3、BQ1、BQ2、BQ3、BQ4、BQ5、BQ6、H1-1、H2-2均屬于小球藻屬，H2-1屬于膠網(wǎng)藻屬。

3 討論

分離鑒定結(jié)果表明，在武漢南湖水、青島海水中小球藻分布較多，小球藻為這兩個(gè)水域的優(yōu)勢(shì)藻種。分離的11株小球藻與文獻(xiàn)所報(bào)道的小球藻的油脂含量一般在15%～55%范圍內(nèi)的研究結(jié)果較一致。其中，小球藻Chlorella sp. BQ6油脂含量高、生長(zhǎng)迅速，可作為進(jìn)一步發(fā)展生物能源的優(yōu)良藻種。研究表明，小球藻可在光照下自養(yǎng)生長(zhǎng)，也可在無(wú)光照條件下異養(yǎng)培養(yǎng)，通過(guò)優(yōu)化其異養(yǎng)生長(zhǎng)的條件，可獲得高油脂含量[12，13]。小球藻是一種球形或橢球形單細(xì)胞綠藻，細(xì)胞大小約2～12 μm，廣泛分布于各種生境，特別是淡水環(huán)境中，適應(yīng)性強(qiáng)、可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞中含有的短鏈脂肪酸與柴油中脂肪酸相近，是一種優(yōu)質(zhì)的生物柴油原料。徐進(jìn)等[14]分離到多株油脂含量高的小球藻，Chlorella sp. NMX37N的藻細(xì)胞中總脂含量可達(dá)到33%左右。韋志勇等[15]從7株小球藻中篩選到1株油脂產(chǎn)率較高的普通小球藻C.vulgaris No. 1，油脂含量和油脂產(chǎn)率分別為23.71%和0.206 g/L。

利用微藻制備綠色能源具有廣闊的前景。為了獲得商業(yè)化生產(chǎn)，許多與脂類合成途徑及油脂調(diào)控相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題需要解決。如有效控制藻類的生長(zhǎng)、脂類代謝，實(shí)現(xiàn)工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng)及下游加工技術(shù)的突破?？蓮囊韵聨讉€(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：①通過(guò)基因工程和優(yōu)化微藻的培養(yǎng)條件而進(jìn)一步提高微藻的油脂含量和生物量；②提高工業(yè)上采用的微藻生物反應(yīng)器的效率；③提取微藻細(xì)胞中的蛋白、碳水化合物等其他營(yíng)養(yǎng)成分，開發(fā)更多的產(chǎn)品。本研究篩選出了高油脂含量的小球藻，后期研究中可進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)對(duì)富油微藻進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)一步提高微藻的油脂含量，為中國(guó)生物能源的生產(chǎn)和開發(fā)提供優(yōu)良的藻種資源。

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