環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶使用性能改善的關(guān)鍵技術(shù)研究

目前，環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)采用酶法工藝，即淀粉在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 3.2.1.19，簡稱CGT酶）作用下通過環(huán)化反應(yīng)合成環(huán)糊精。CGT酶生產(chǎn)環(huán)糊精最不利的條件之一是產(chǎn)物特異性差，這使產(chǎn)物的分離純化很不方便。同時(shí)，CGT酶的另一缺陷是其熱穩(wěn)定性較差。由于在環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)中，底物淀粉首先要經(jīng)過高溫糊化、液化處理，然后降溫至適當(dāng)溫度進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，若CGT酶能夠適應(yīng)更高的反應(yīng)溫度，勢(shì)必有助于提高反應(yīng)效率。改善CGT酶產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，提高該酶的使用性能，將其應(yīng)用于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)中，能顯著降低環(huán)糊精的成本，促進(jìn)環(huán)糊精在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

Goh,Poh Hong等 (2012)研究了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶鈣離子結(jié)合位點(diǎn)處的理性突變提高其熱穩(wěn)定性，構(gòu)建了4種突變體——S182G、S182E、N132R和N28R。Leemhuis,H等 （2004）通過引入鹽橋來提高來源于Bacillus circulans的CGT酶的熱穩(wěn)定性。Lee,SH等（2002）研究了CGT酶環(huán)化活力和熱穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)及其作為保鮮酶的應(yīng)用。為了降低其環(huán)化活力，將191和255位的苯丙氨酸分別被甘氨酸（F191G-CGTase ET1）和異亮氨酸（F255I-CGTase ET1）取代。兩種突變體的最適溫度均低于野生型酶，環(huán)化活力下降明顯，但是相比于野生型酶，F(xiàn)255I-CGTase ET1的水解活力增加了2倍。Van Der Veen,BA等 （2000）研究了來源于Bacillus circulans strain 251的CGT酶中Arg47在環(huán)化和偶合反應(yīng)中的作用——產(chǎn)物抑制和產(chǎn)物特異性。Yamamoto,T（2000）采用定點(diǎn)突變改變來源于Thermococcus sp B1001的CGT酶產(chǎn)物特異性，基于來源于Bacillus circulans no.8的CGT酶的底物結(jié)合模型，Tyr100，Trp191和Tyr267被確認(rèn)參與定位直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)并且通過糖類與芳烴的相互作用減少環(huán)糊精分子的大小，結(jié)果表明Tyr267對(duì)B1001來源的CGT酶催化產(chǎn)生α-環(huán)糊精起著非常重要的作用。

江南大學(xué)顧正彪教授課題組對(duì)改善環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶使用性能的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了深入的研究。如，CN201310153421.3采用定點(diǎn)突變方法提高CGT酶的產(chǎn)β-環(huán)糊精能力，提供了提高Bacillus circulans STB01CGT酶產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶中鈣離子結(jié)合位點(diǎn)處第315位丙氨酸突變?yōu)榫彼?Arg)或天冬氨酸(Asp)，獲得突變體A315R和A315D。相比于野生CGT酶，這兩種突變體具有更高的產(chǎn)β-環(huán)糊精能力，更適合β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。CN201410506112.4公開了一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的第599位的丙氨酸突變?yōu)樘於０?，得到單突變體A599N。CN201410169754.X公開了一種提高環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化活力的方法。該發(fā)明采用定點(diǎn)突變方法將來源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶的第577位天冬氨酸（Asp）分別突變?yōu)楸彼幔ˋla）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）或賴氨酸（Lys），所得突變體相比于野生CGT酶，環(huán)化活力明顯提高，更適合環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。CN200910029153.8利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法提高一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶)產(chǎn)β-環(huán)糊精能力，提供了提高來源于Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M 208063)的CGT酶產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的突變方案，將CGT酶的47位的Lys分別替換成Arg，His及Thr，獲得的三種突變體酶K47R，K47H，K47T，它們的β-環(huán)糊精生產(chǎn)能力較野生型CGT酶有所提高；其中，突變體酶K47T尤為顯著。CN201410050707.3通過納米硅溶膠與聚乙二醇的協(xié)同添加顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，大大提高了酶的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。鄭賢良等（2011）通過向重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-CGT酶)液中添加化學(xué)添加劑以提高其熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性.在不同溫度下研究了添加劑對(duì)酶液的貯存穩(wěn)定性影響,并用圓二色譜(CD)研究了CGT酶在近紫外區(qū)和遠(yuǎn)紫外區(qū)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性的變化關(guān)系。

隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者已經(jīng)開始對(duì)CGT酶進(jìn)行遺傳修飾，進(jìn)一步研究該酶的特性及催化機(jī)制，從而有助于CGT酶催化效率及產(chǎn)物選擇性的進(jìn)一步提高。

（江南大學(xué)圖書館 張群）