孔 峰， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

重組枯草芽孢桿菌高產(chǎn)氨肽酶策略與提取工藝優(yōu)化

孔 峰， 田亞平*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

研究不同的產(chǎn)酶促進(jìn)劑（滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、有機酸鹽）對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶的影響，并對氨肽酶的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。獲得產(chǎn)酶促進(jìn)劑優(yōu)化組合為：氯化鉀0.1 mol/L、吐溫802.4 μL/mL、L-谷氨酸鈉0.6%、酒石酸鉀0.7%；優(yōu)化培養(yǎng)條件為：裝液量60 mL/250 mL、初始pH 7.5、接種體積分?jǐn)?shù)5%、轉(zhuǎn)速220 r/min、培養(yǎng)時間36 h。在上述優(yōu)化條件下，該重組菌株產(chǎn)氨肽酶酶活達(dá)232.5 U/mL，是優(yōu)化前的3.32倍。該重組氨肽酶發(fā)酵液經(jīng)低速離心、雙水相萃取、超濾濃縮提取后，回收率達(dá)67.23%，純化倍數(shù)為8.29。

氨肽酶；發(fā)酵優(yōu)化；提取工藝

氨肽酶作為一種外切型蛋白酶，可切除蛋白質(zhì)和多肽鏈N-末端的氨基酸殘基，因而具有提高蛋白質(zhì)原料的水解度，脫除蛋白質(zhì)水解液的苦味及制備多功能活性肽等作用，在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、飼料等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[1-2]。

在酶制劑生產(chǎn)過程中，高產(chǎn)和高回收率往往是人們不斷追求的目標(biāo)。高產(chǎn)的策略往往可以從3方面入手：1）優(yōu)良菌種的選育和工程菌構(gòu)建；2）產(chǎn)酶過程的條件優(yōu)化；3）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑。優(yōu)良菌種的選育和工程菌構(gòu)建是酶制劑生產(chǎn)的前提，良好的菌種能夠大大提高產(chǎn)酶量，如汪曉東[3]利用重組質(zhì)粒與原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得重組轉(zhuǎn)化菌，產(chǎn)酶水平是出發(fā)菌的16倍。適合的培養(yǎng)條件對提高和穩(wěn)定產(chǎn)酶水平有較大的作用，如須瑛敏[4]對氨肽酶野生菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，氨肽酶的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了4.58倍。在此基礎(chǔ)上，添加適量的產(chǎn)酶促進(jìn)劑，往往可以進(jìn)一步提高產(chǎn)酶量和生產(chǎn)效率。

我們把能夠促進(jìn)產(chǎn)酶的物質(zhì)統(tǒng)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑，它包括誘導(dǎo)物、有機酸鹽、表面活性劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。誘導(dǎo)物一般是酶的作用底物或底物類似物，也可以是酶反應(yīng)產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物，如木霉菌生產(chǎn)纖維素酶時，添加槐糖作為誘導(dǎo)物能有效地縮短產(chǎn)酶間隔時間[5]；表面活性劑一般會增加細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的酶易于分泌出來從而提高產(chǎn)酶。如劉軍[6]等人研究發(fā)現(xiàn)，吐溫80對嗜熱脂肪芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞外高溫蛋白酶有一定促進(jìn)作用，添加0.1%吐溫80可使發(fā)酵液酶活提高12.7%；有機酸鹽提高產(chǎn)酶的原因有很多，如有機酸鹽可以作為細(xì)胞內(nèi)某些酶或輔酶的前體物質(zhì)，或者可以促進(jìn)這些前提物質(zhì)的合成[7-8]；有機酸鹽還可以作為小分子調(diào)節(jié)劑，它的有機酸根可以作為一種金屬離子螯合劑[9]，可以螯合某些重要的金屬離子，進(jìn)而影響酶合成的性能。如吳青[10]在對平菇液態(tài)發(fā)酵稻草秸稈產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶系的過程中，加入1 mmol/L醇酸鹽能夠提高漆酶酶活達(dá)2.05倍。

本課題組高新星[11]構(gòu)建了一株產(chǎn)氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌，曹松龍[12]對此菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，作者在他們工作的基礎(chǔ)上，利用產(chǎn)酶促進(jìn)劑對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；利用雙水相萃取技術(shù)優(yōu)化提取工藝，以提高氨肽酶的產(chǎn)量、簡化提取工藝并提高氨肽酶的回收率和純化倍數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

重組枯草芽孢桿菌：從枯草芽孢桿菌Zj016篩選得到氨肽酶的基因，并在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系中實現(xiàn)高效表達(dá)。

1.2 主要試劑和儀器

酵母浸膏、K2HPO4、CoCl2、可溶性淀粉、甘油、聚乙 二 醇 600 （PEG600）、PEG1000、PEG2000、PEG4000、硫酸銨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)R250：均為分析純。

BCD-208K型低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；722型分光光度計：上海第三分析儀器廠；SHZ-22電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；高速冷凍離心機himac CR22G：日本日立（HITACHI）公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 取適量的保存菌液接種到種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)：37℃、220 r/min培養(yǎng)10 h。

1.3.2 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)36 h。

1.3.3 制備粗酶液 菌種活化后接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)36 h。離心后取上清液，4℃保存。

1.3.4 雙水相萃取法 固定雙水相萃取體系的總質(zhì)量為10 g，將一定量確定濃度的PEG和硫酸銨溶液混合，加入2 mL的粗酶液，不足的部分以蒸餾水補充。萃取后，靜置一段時間，當(dāng)兩相達(dá)到相分離后，分別測定上相和下相的體積、酶活力、蛋白質(zhì)含量。相關(guān)計算公式如下：相比（R）=上相體積/下相體積；酶活力分配系數(shù)（Ke）=上相酶活力/下相酶活力；蛋白質(zhì)分配系數(shù) （Kp）=上相蛋白含量/下相蛋白含量；收率（Ye）=1/（1+RKe）；純化倍數(shù)=下相中氨肽酶比酶活/發(fā)酵液中氨肽酶比酶活。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=1.001 5X+0.014 8 （R2=0.998）

式中，Y為波長405 nm處測定的吸光值；X為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.6 L-亮氨酸氨肽酶的酶活力測定 采用紫外分光光度法（LNA法），于2 mL、50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中加入1 mL稀釋一定倍數(shù)的酶液，然后加入1 mL的L-亮氨酸-對硝基苯胺，混合均勻，50℃水浴反應(yīng)10 min，于405 nm處測定吸光值。計算公式為：

式中，X為樣品的酶活力 （U/mL）；N為405 nm處測定的吸光值；Y為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

酶活力的定義：在特定條件下（50℃），每分鐘催化L-亮氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol的對硝基苯胺所需的酶量，即為一個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵優(yōu)化

2.1.1 滲透壓調(diào)節(jié)劑對產(chǎn)酶的影響 在初糖濃度較低的培養(yǎng)基中，微生物生長環(huán)境中的滲透壓較低，考慮到滲透壓對氨肽酶的產(chǎn)生有可能有較大影響，以氯化鈉、氯化鉀、甘露醇、蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)為對照，種子液以4%的接種體積分?jǐn)?shù)到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)36 h。

微生物對環(huán)境的滲透壓有一定的適應(yīng)范圍，在此范圍內(nèi)，當(dāng)微生物生長的環(huán)境中水活度下降時，細(xì)胞內(nèi)的水分會流向環(huán)境，處于低水活度中的微生物細(xì)胞用于抵御細(xì)胞內(nèi)水分流失的通常機制是，提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種相溶性物質(zhì)的累積[13]。由圖1～圖4可知，4種滲透壓調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞生長有一定的影響，加入滲透壓調(diào)節(jié)劑后，生物量比對照明顯減小，這說明過高的滲透壓會抑制細(xì)胞生長。當(dāng)以氯化鈉、氯化鉀作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時，濃度分別在0.3、0.1 mol/L時酶活達(dá)到最大值，分別是102、110 U/mL，綜合考慮，選擇的氯化鉀作為促進(jìn)產(chǎn)酶的滲透壓調(diào)節(jié)劑。

圖1 甘露醇對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 1 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of mannitol

圖2 蔗糖對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 2 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of sucrose

圖3 氯化鈉對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 3 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of NaCl

圖4 氯化鉀對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 4 ffects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of KCl

2.1.2 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響 在搖瓶培養(yǎng)中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、SDS等4種表面活性劑，以不添加表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)作為對照，分別考察表面活性劑對重組枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)酶的影響。

表面活性劑一方面對難溶的疏水性有機物有增溶作用，加強了有機相和水相的傳質(zhì)作用，以提高微生物對有機物的利用。另一方面，表面活性劑具有改變細(xì)胞膜通透性的作用，加快了細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)傳遞[14]。由圖5～圖8可知，4種表面活性劑對細(xì)胞的生長都有一定的抑制作用，隨著濃度的增加，酶活均先增加后減小，其中，以吐溫80作為表面活性劑時，酶活變化較為明顯，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為2.0 μL/ mL時，酶活達(dá)到152 U/mL。綜合考慮，選擇吐溫80作為促進(jìn)產(chǎn)酶的表面活性劑。

圖5 吐溫80對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 5 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of Tween-80

圖6 吐溫20對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 6 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of Tween-20

圖7 曲拉通X-100對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 7 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of triton X-100

圖8 SDS對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig. 8 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of SDS

2.1.3 有機酸鹽對產(chǎn)酶的影響 在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入檸檬酸鈉、酒石酸鉀、L-谷氨酸鈉、乙二酸鈉4種有機酸鹽，以不添加有機酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)作為對照，分別考察有機酸鹽對重組枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)酶的影響。

一般來說，有機酸鹽是通過提高微生物產(chǎn)酶性能來提高酶的合成，而不是僅通過提高微生物生長的群體優(yōu)勢來提高的。如圖9～圖12可知，4種有機酸鹽均能促進(jìn)酶的合成，其中，酒石酸鉀和L-谷氨酸鈉對酶合成的促進(jìn)作用最好，當(dāng)兩者質(zhì)量濃度分別為0.7、0.5 g/dL時，酶活力分別達(dá)到122、157 U/mL。

圖9 檸檬酸鈉對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig.9 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of Sodium citrate

圖10 酒石酸鉀對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig.10 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of potassium tartrate

圖11 L-谷氨酸鈉對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig.11 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of L-sodium glutamate

圖12 乙二酸鈉對產(chǎn)酶和生物量的影響Fig.12 Effects of aminopeptidase production by recombinant Bacillus subtilis in the present of sodium oxalate

2.1.4 正交實驗 為提高搖瓶發(fā)酵酶活，綜合考慮單因素實驗結(jié)果，以酶活為考察指標(biāo)，以氯化鉀濃度（A）、吐溫80體積分?jǐn)?shù)（B）、L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度（C）、酒石酸鉀質(zhì)量濃度（D）為考察因素，采用L9（34）正交實驗，結(jié)果見表1。

表1 正交實驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiments

可以看出，氯化鉀、吐溫80、L-谷氨酸鈉、酒石酸鉀四種因素對發(fā)酵酶活的影響程度依次為：氯化鉀＞吐溫80＞L-谷氨酸鈉＞酒石酸鉀。最優(yōu)組合為：氯化鉀0.1 mol/L、吐溫80 2.4 μL/mL、L-谷氨酸鈉0.6 g/dL、酒石酸鉀0.7 g/dL。在此組合下發(fā)酵液酶活達(dá)到207.6 U/mL。4種促進(jìn)產(chǎn)酶的方法中，空白對照組的酶活有些差異，出現(xiàn)這種情況的原因可能是系統(tǒng)誤差。

2.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 在獲得最優(yōu)產(chǎn)酶促進(jìn)劑組合后，對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)培養(yǎng)條件為：最適培養(yǎng)溫度37℃、最適裝液量60 mL/250 mL、最適初始pH 7.5、最適轉(zhuǎn)速220 r/min、最適接種體積分?jǐn)?shù)5%、培養(yǎng)時間36 h。在此條件下對重組枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，氨肽酶酶活達(dá)到232.5 U/mL。

2．2 提取工藝優(yōu)化

本課題組原有對氨肽酶的提取工藝為：發(fā)酵液絮凝→過濾除菌→鹽析→離心→超濾濃縮→冷凍干燥，該提取工藝所需提取步驟較多、提取時間較長、不便于連續(xù)操作和過程放大。為更好的適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求，對氨肽酶的提取工藝進(jìn)一步的優(yōu)化，通過發(fā)酵液低速離心→雙水相萃取→超濾濃縮→冷凍干燥等步驟，使提取工藝易于連續(xù)操作和過程放大，降低能耗，縮短提取時間。

2.2.1 雙水相萃取條件確定

1）PEG相對分子質(zhì)量對酶分離純化的影響：以15%的硫酸銨為成相鹽，分別以15%的PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000作為成相聚合物，加入2 mL的粗酶液，構(gòu)成10 g雙水相萃取體系?？疾觳煌鄬Ψ肿淤|(zhì)量的PEG對酶萃取的影響，當(dāng)兩相達(dá)到相分離后，兩相界面出現(xiàn)白色膜狀沉淀物，氨肽酶主要分配于下相，實驗結(jié)果見表2。

表2 不同相對分子質(zhì)量的PEG對酶分離純化的影響Table 2 Effects of different PEG molecular weights on aqueous two phase extraction of aminopeptidase

由表2可以看出：隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，相比與蛋白質(zhì)分配系數(shù)都逐漸下降，回收率逐漸上升。這主要是由于同一聚合物的疏水性隨著相對分子質(zhì)量的增加而增大，當(dāng)PEG相對分子質(zhì)量增加時，在質(zhì)量濃度不變的情況下，其兩端的羥基數(shù)減少，疏水性增加，親水性的蛋白質(zhì)不再向富含PEG相中聚集，而轉(zhuǎn)向另一相，另一方面，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，體系的黏度增加，不利于蛋白質(zhì)分子在相與相之間的轉(zhuǎn)移[15]。綜合回收率和純化倍數(shù)考慮，PEG相對分子質(zhì)量為1 000時萃取效果較好。故選擇PEG1000作為成相聚合物。

2）硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶分離純化的影響：選用15%的PEG1000為成相聚合物，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硫酸銨作為成相鹽，加入2 mL粗酶液，構(gòu)成10 g雙水相萃取體系?？疾觳煌|(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨對酶萃取的影響，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，兩相界面出現(xiàn)的白色膜狀沉淀物變多，氨肽酶主要分配于下相，結(jié)果見表3。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨對酶分離純化的影響Table 3 Effects of（NH4）2SO4concentrations on aqueous two phase extraction of aminopeptidase

雙水相萃取體系的形成過程是PEG與硫酸銨相互爭奪水分子的過程，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，水分子趨向分配于鹽相，使得相比減小。由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，使得蛋白質(zhì)表面的水化層被破壞，發(fā)生蛋白質(zhì)的鹽析作用，使得酶回收率下降[16]。實驗表明，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，相比逐漸減小，蛋白質(zhì)分配系數(shù)逐漸增大。綜合酶的回收率和酶的純化倍數(shù)考慮，當(dāng)硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時，有利于酶的分離純化。

3）PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶分離純化的影響：選用18%硫酸銨作為成相鹽，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000為成相聚合物，加入2 mL粗酶液，構(gòu)成10 g雙水相萃取體系?？疾觳煌琍EG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶萃取的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000對酶分離純化的影響Table 4 Effects of PEG1000 concentrations on aqueous two phase extraction of aminopeptidase

在PEG1000/硫酸銨雙水相萃取體系中，當(dāng)PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對增加時，一方面，親水集團增加，親水性增強，疏水作用降低，表面張力減弱，相比變大，使得體系內(nèi)蛋白質(zhì)趨向分配于上相；另一方面，體系的黏度增加，兩相間界面張力增加，蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移難度變大。兩種因素的共同作用影響分離純化效果[17]。如表4所示，隨著PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，相比也增加，酶的回收率減小，蛋白質(zhì)分配系數(shù)先減小后增加。綜合考慮酶的回收率和純化倍數(shù)，當(dāng)PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，分離純化效果較好。

4）氯化鈉質(zhì)量濃度對酶分離純化的影響：為考察不同質(zhì)量濃度的氯化鈉對分離純化的影響，作者以18%硫酸銨作為成相鹽，10%的PEG1000為成相聚合物，加入2 mL粗酶液，構(gòu)成10 g雙水相萃取體系，結(jié)果見表5。

表5 不同質(zhì)量濃度的氯化鈉對酶分離純化的影響Table 5 Effects of NaCl concentrations on aqueous two phase extraction of aminopeptidase

由于鹽的正負(fù)離子在兩相間的分配系數(shù)不同，而兩相均須保持電中性，因而在兩相中產(chǎn)生電位差，這對帶電生物大分子的分配產(chǎn)生很大影響。適當(dāng)提高離子強度可以加快分相速度，并提高目的產(chǎn)物的選擇性[18]。從表5可以看出，隨著氯化鈉質(zhì)量濃度的增加，相比、酶的回收率和蛋白質(zhì)分配系數(shù)都先增加后逐漸減小，綜合考慮，當(dāng)氯化鈉添加量為1 g/dL時，分離純化效果較好。

5）pH對酶分離純化的影響：作者以18%硫酸銨作為成相鹽，10%的PEG1000為成相聚合物，加入2 mL粗酶液，構(gòu)成10 g。用鹽酸分別調(diào)節(jié)體系pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0?？疾觳煌琾H環(huán)境對分離純化的影響，結(jié)果見表6。

表6 不同pH對酶分離純化的影響Table 6 Effects of different pH values on aqueous two phase extraction of aminopeptidase

體系中的pH一方面可以影響蛋白質(zhì)中可解離基團的解離度，從而改變蛋白質(zhì)的所帶電荷和分配系數(shù)，另一方面可以影響鹽的解離程度，改變兩相間的電位差，從而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)[19-20]。從表6可以看出，體系pH對相比的影響較小，回收率隨著pH值的變大而逐漸降低。蛋白質(zhì)分配系數(shù)先減小后增加。綜合來看，體系pH為8.0時，酶的收率為95.3%，純化倍數(shù)達(dá)到3.234，此時的pH對分離純化最為有利。

2.2.2 重組枯草芽孢桿菌氨肽酶提取工藝的優(yōu)化結(jié)果 雙水相萃取體系經(jīng)放大后，應(yīng)用到氨肽酶提取工藝中，發(fā)酵液最低速離心除去菌體和殘留豆粕后，量取710 g發(fā)酵液上清液，加入氯化鈉10 g、硫酸銨180 g、PEG1000 100 g，調(diào)節(jié)pH為8.0，構(gòu)建1 000 g的雙水相萃取體系進(jìn)行氨肽酶的萃取，萃取后，下相萃取液在0.20 MPa的操作壓力下，選擇30 000的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮脫鹽，控制酶液濃縮倍數(shù)為3倍，結(jié)果見表7。

表7 氨肽酶提取工藝各步分離結(jié)果Table 7 Optimization results of the extraction of aminopeptidase

從表7可以看出，大多數(shù)雜蛋白質(zhì)在雙水相萃取下相中被有效地去除，氨肽酶的最后回收率為67.23%，純化倍數(shù)為8.29。該方法相對于原來提取方法來說，操作步驟少、所需時間短、回收率有一定的增加、純化倍數(shù)提高4.7倍?？傮w看來，該提取方法，即發(fā)酵液低速離心→雙水相萃取→超濾濃縮→冷凍干燥能夠有效地分離提純氨肽酶。

3 結(jié)語

利用多種產(chǎn)酶促進(jìn)劑提高重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶的能力，并對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過單因素和正交實驗獲得產(chǎn)酶促進(jìn)劑最優(yōu)組合。發(fā)酵結(jié)果表明，產(chǎn)酶促進(jìn)劑能夠有效的促進(jìn)重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶，在最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，氨肽酶酶活達(dá)到232.5 U/mL，是優(yōu)化前的3.32倍。對原有的氨肽酶提取工藝進(jìn)行優(yōu)化后，氨肽酶的回收率和純化倍數(shù)都有所增加，且能耗和提取時間都下降，工藝流程變得簡單，易于過程放大。

近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，酶制劑的應(yīng)用領(lǐng)域不斷延伸，這使得酶制劑行業(yè)受到人們越來越廣泛的關(guān)注。其中氨肽酶已在多個行業(yè)（食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、飼料等）內(nèi)有較為廣泛的應(yīng)用，對氨肽酶的需求量增加，因而提高氨肽酶的產(chǎn)量及簡化氨肽酶提取工藝就變得越來越重要。

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Strategy to Obtain High Yield of Aminopeptidase from Recombinant Bacillus subtilis and Its Extraction Process Optimization

KONG Feng， TIAN Yaping*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This study aimed to investigate the effects of different enzyme accelerants on the production of aminopeptidase by recombinant Bacillus subtilis and develop an efficient extract process of aminopeptidase.The results indicated that the enzyme accelerants（KCl at 0.1 mol/L，Tween-80 at 2.4 μL/mL，L-glutamate at 0.6%，potassium tartrate at 0.7%）significantly increased the production of aminopeptidase.The cultural conditions were of 60 mL/250 mL of liquid，5% inoculation size，at 37℃，initial pH 7.5，shake flask rotation 220 r/min，and cultured time 36 h. Under these conditions，the aminopeptidase activity of recombinant Bacillus subtilis could reach 232.5 U/mL.Using the efficient extract process of aminopeptidase，the recovery and the purification fold of the L-leucine aminopeptidase could reach 67.23%and 8.29，respectively.

aminopeptidase，optimization of fermentation，extraction process

Q 55

A

1673—1689（2015）08—0864—09

2014-04-29

國家863計劃項目（2011AA100905）。

*通信作者：田亞平（1964—），女，安徽淮南人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物活性物質(zhì)方面的研究。E-mail：yapingtian@hotmail.com