柯 璐， 黃曉蓉*， 林 杰， 戴曉麗， 曾維揚(yáng)， 張溫玲

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

腸炎沙門氏菌gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究

柯 璐1，2， 黃曉蓉*1，2， 林 杰1，2， 戴曉麗1，2， 曾維揚(yáng)1，2， 張溫玲1，2

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

作者對制備腸炎沙門氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（gDNA）進(jìn)行初探，共制備200支樣品，每支約含有腸炎沙門氏菌gDNA 1 μg。方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)值為0.835 7，小于F0.05（14，30）=1.68，表明在95%顯著性水平時(shí)，樣品的gDNA含量均勻；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明樣品在-20℃下保存12個(gè)月，gDNA含量維持在1 μg/支，0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳的目標(biāo)條帶清晰，以invA基因?yàn)橐锏腜CR反應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶清晰，樣品均具有較好的穩(wěn)定性。

腸炎沙門氏菌；核酸；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

福建省曾因微生物污染遭遇國際貿(mào)易壁壘的抵制而使得出口商家損失巨大。20世紀(jì)90年代以來，以核酸為基礎(chǔ)的基因診斷技術(shù)發(fā)展迅速，并在食品微生物領(lǐng)域逐漸成為出入境口岸檢驗(yàn)檢疫中快速檢測方法之一。由于國內(nèi)在快速檢測方面沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各試劑盒采用的標(biāo)準(zhǔn)也各有不同，使得結(jié)果相差甚大，給進(jìn)出口產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫帶來很大的誤差[1]。要解決檢測的標(biāo)準(zhǔn)化問題以及提高檢測的有效性，需要一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在國際上，生物成分的gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，大部分都是針對人類及一些真核生物，而關(guān)于細(xì)菌的基因組標(biāo)物卻比較少，目前歐盟執(zhí)委會(huì)聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)與測量研究院（IRMM）有研制細(xì)菌基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[2]，在國內(nèi)卻很少有報(bào)道。腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，SE）是引起食物中毒的常見致病菌，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展和人類健康[3]，作者對腸炎沙門氏菌 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行研究制備，為gDNA標(biāo)物的研制提供可行的技術(shù)路線。

1 材料與方法

1.1 菌源及引物

腸 炎 沙 門 氏 菌 Salmonella enteritidis（ATCC13076）：購自上海漢尼公司；引物 invA（286bp）：由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；invA-1：5'-GTGA AATT TACG CCAC GTTC GGGC AA-3'；invA-2：5'-TCAT CGCA CCGT CAAA GGAA CC-3'

1.2 主要儀器及耗材

多 功 能 酶 標(biāo) 儀 ：Molecular Devices公 司SpectraMax M5； 核酸蛋白儀：Eppendorf公司Biophotometer；全自動(dòng)變焦凝膠成像系統(tǒng)：美國KODAK公司GL212Pro；電泳儀、水平電泳槽系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司，Powerpac通用型、SUBCELLGT；冷凍干燥機(jī)：美國LABCONC公司，F(xiàn)reeZone○RTriadTM2.5L；凍存管：京中生柏奧生物科技有限公司，0.5 mL。

1.3 主要試劑

緩沖蛋白胨：北京陸橋公司；Puregene Yeast/ Bact.Kit B試劑盒：QIAGEN公司；通用型DNA純化回收試劑盒：北京天根生化科技有限公司；λDNA：Promega公 司 產(chǎn) 品 ；λDNA/Hind III+ EcoR I Marker：上海英駿生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR MasterMix：自北京天根生化科技有限公司；100 bp DNA Ladder Marker：北京天根生化科技有限公司；Picogreen熒光染料等。

2 SE gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法

2.1 高濃度gDNA提取

核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量關(guān)鍵在于基因組必須具有較好的完整性，且A260/280在1.70～1.90[4]。經(jīng)比較，QIAGEN公司生產(chǎn)的Puregene Yeast/Bact.Kit B for Purification of Archive-quality DNA from Gram-Positive BacteriaCulture Medium試劑盒提取過程相對簡便快捷，且基因組質(zhì)量優(yōu)良。取新鮮培養(yǎng)菌液（菌濃度達(dá)到0.5×109～1.5×109cells），按試劑盒步驟進(jìn)行提取。

2.2 gDNA濃度測定

利 用 pH 8.0 TE 溶 液 按 200：1比 例 對Picogreen染料原液進(jìn)行稀釋，充分混合后避光保存待用。將1 μL DNA樣品與99 μL、pH 8.0 TE溶液混合，50℃孵育5 min，每個(gè)待測樣品做兩個(gè)平行，孵育后樣品與100 μL Picogreen工作試劑混合。同時(shí)，選用溶度為2 μg/mL的λDNA作為外標(biāo)物，選取6個(gè)體積控制點(diǎn)，與pH 8.0 TE溶液及100 μL Picogreen工作試劑混合，最終稀釋度見表1?；旌弦嚎焖冱c(diǎn)入96 Well corning黑色熒光板中，避光孵育5 min，于多功能酶標(biāo)儀上檢測。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備設(shè)計(jì)Table 1 Protocol for preparing standard curve

2.3 gDNA的核酸電泳及特征性驗(yàn)證

2.3.1 核酸電泳 取7 μL的gDNA與 6×Loading Buffer混合，1.0 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳，設(shè)計(jì)10個(gè)平行，98 V下電泳約80 min，EB染色30 min，利用全自動(dòng)變焦凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。

2.3.2 invA基因擴(kuò)增 以invA（286 bp）為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，10管平行實(shí)驗(yàn)，每管25.0 μL反應(yīng)體系，詳見表2。

表2 PCR-25反應(yīng)體系Table 2 PCR-25 reaction system

PCR擴(kuò)增反應(yīng)熱力學(xué)循環(huán)參數(shù)為：95℃、5 min預(yù)變性，95℃、30 s變性，64℃、30 s退火，72℃、30s延伸，共35個(gè)循環(huán)，25℃保溫。

分別取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳，200 V下跑膠約20 min，EB染色30 min，利用全自動(dòng)變焦凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。

2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化回收、測序 按照Universal DNA Purification Kit步驟對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化。取純化產(chǎn)物1 mL于離心管中，蓋口封膜后送至上海生工進(jìn)行克隆測序。將測序獲得的基因序列進(jìn)行在線 BLAST，分析比對結(jié)果是否存在差異，以此作為gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征標(biāo)志。

2.3 制備gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

2.3.1 冷凍干燥程序的選擇 制備的gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行冷凍干燥后密封保存。針對冷凍干燥過程中對結(jié)果影響較大的兩個(gè)因素水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以凍干后gDNA質(zhì)量濃度為指標(biāo)，選擇適合的冷凍干燥程序，每個(gè)水平設(shè)置6個(gè)重復(fù)，主要分析因素及水平見表3。

表3 冷凍干燥影響因素及水平設(shè)計(jì)Table 3 Influence factor and level design of Freeze drying

2.3.2 gDNA的分裝 將gDNA溶液用pH 8.0 TE溶液稀釋后分裝于凍存管，100 μL/支，于-70℃預(yù)凍5 h后，置于冷凍干燥機(jī)按2.3.1程序凍干。

2.3.4 凍干樣品的均勻性驗(yàn)證及定值

1）樣品gDNA含量（μg）測定：抽取15支凍干樣品，加100 μL、pH 8.0 TE溶液，室溫下溶解2 min，于渦旋振蕩儀上低速渦旋20 s，置于50℃干浴鍋中溶解5 min，每支樣品設(shè)置3個(gè)平行，樣品最終質(zhì)量濃度cZ（μg/μL）取平均值計(jì)，gDNA樣品質(zhì)量（μg）=100 μL×cZ。參照CNAS-GL03：2006《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》要求，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行驗(yàn)證。

2）不確定度評(píng)估 測量不確定度主要由The PicofluorTM熒光計(jì)的測量中產(chǎn)生，評(píng)估方法如下：抽取樣本數(shù)為n=10，每個(gè)樣本進(jìn)行平行3次的測量，標(biāo)準(zhǔn)不確定度 U=Sx/n1/2。

2.3.5 對凍干樣品進(jìn)行特征性驗(yàn)證及穩(wěn)定性追蹤對抽取的 10份樣品同時(shí)進(jìn)行以invA為引物的PCR擴(kuò)增。模擬-20、4、25、60℃4個(gè)保存溫度，對gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分組保存。在不同時(shí)間段，每個(gè)保存溫度各抽取3份樣品，以gDNA濃度、核酸電泳及特征性擴(kuò)增為指標(biāo)，進(jìn)行穩(wěn)定性追蹤[5-7]。

3 結(jié)果與討論

3.1 gDNA質(zhì)量濃度及特征性檢測

將提取的gDNA混合，混合后質(zhì)量濃度為96 μg/mL，A260/A280=1.87。將gDNA溶液分裝于17支1.5 mL離心管中，1 mL/支，于-20℃保存待用。

由圖1—2可知，9條 gDNA溶液電泳條帶清晰，條帶均在20 kb左右。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳條帶清晰，無明顯雜帶，與陽性對照條帶位置一致。由圖3可知，將測序的結(jié)果以FASTA的格式上傳至http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行nucleotide blast，數(shù)據(jù)庫選擇nucleotide collection（nr/nt）。測序峰圖結(jié)果顯示其信號(hào)強(qiáng)，無明顯干擾，清晰可見。進(jìn)行nucleotide blast，結(jié)果為Identities=100%。

圖1 gDNA核酸電泳圖Fig.1 gDNA nucleic acid electrophoresis

圖2 gDNA PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖Fig.2 GDNA PCR reaction product electrophoresis

圖3 測序比對結(jié)果Fig.3 Sequence alignment result

3.2 冷凍干燥因素結(jié)果及分析

由表4可知，當(dāng)程序設(shè)定為隔板控溫-40℃運(yùn)行7 h，隔板控溫4℃運(yùn)行5 h時(shí)，gDNA凍干后質(zhì)量濃度最高。將gDNA溶液稀釋至15 μg/mL后按照凍干程序進(jìn)行冷凍干燥，凍干后樣品用Parafilm封口膜封閉瓶蓋。

表4 冷凍干燥試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experiment results of Freeze drying

3.3 樣品的濃度及均勻性結(jié)果

抽取的15支樣品，利用熒光值法分別測定3次，cz=11 μg/mL，均勻性結(jié)果見表5。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

F值=0.835 7，小于F0.05（14，30）=1.68，這表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品中的gDNA含量是均勻的。

3.4 研制方法的不確定度分析與評(píng)估

經(jīng)計(jì)算，單次測量結(jié)果試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差：S=3.529，則U=0.6442。因此，當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果以3次測量值的平均值表示時(shí)，其值區(qū)間分布于（11±0.644 2）μg/mL之間，這個(gè)取值區(qū)間適合于任何一次測量。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性追蹤

3.5.1 樣品質(zhì)量濃度穩(wěn)定性追蹤 4種保存溫度下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)gDNA質(zhì)量濃度與t=0的gDNA質(zhì)量濃度對比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性結(jié)果Table 6 Stability test results

由表6可見，樣品在-20℃下保存12個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度穩(wěn)定，在4℃下保存半年后，gDNA開始降解。而在25℃及60℃下存儲(chǔ)，gDNA樣品降解快，不穩(wěn)定。

3.5.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 每個(gè)保存溫度抽取3支樣品進(jìn)行核酸電泳，同時(shí)進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳。結(jié)果表明，在－20、4、25℃下保存12個(gè)月，gDNA電泳條帶清晰，無明顯雜帶。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在-20、4、25℃下保存12個(gè)月均能擴(kuò)增出invA。而保存溫度為60℃時(shí)，雖invA特征基因能被擴(kuò)增出，但gDNA電泳結(jié)果無條帶。

4 結(jié)語

本研究制備的腸炎沙門氏菌gDNA標(biāo)物共200支，具備一定的穩(wěn)定性和均勻性，給核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備及驗(yàn)證方法提供了有效的依據(jù)，并建立起適用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值的方法及不確定度的評(píng)估方案，作為制備成果適用性的理論依據(jù)。

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Study on the Reference Materials of Salmonella enteritidis Nucleic Acid

KE Lu1，2， HUANG Xiaorong*1，2， LIN Jie1，2， DAI Xiaoli1，2， ZENG Weiyang1，2， ZHANG Wenling1，2
（1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，F(xiàn)uzhou 350001；Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，F(xiàn)uzhou 350001）

The preparation of nucleic acid reference materials of Salmonella Enteritidis（gDNA）was carried out in this study.A total of 200 samples were prepared，each of them contained 1 μg of Salmonella Enteritidis gDNA.Variance analysis results showed that F value was 0.835 7＜F0.05（14，30）=1.68，indicating that gDNA con ple was evenly in the 95%significance level.Stability tests showed that gDNA content of the samples was maintained at 1 μg/support after stored for 12 months at the temperature of-20℃.The goal electrophoresis band of 0.8 g/dL agarose gel and the electrophoresis bands of PCR reaction product by using the invA gene as primers were clear revealed that the property of samples were stable.

Salmonella enteritidis，gDNA，reference materials

Q93-331

A

1673—1689（2015）08—0891—05

2014-04-21

福建省科學(xué)技術(shù)廳社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目（2011Y0002）。

*通信作者：黃曉蓉（1958—），江蘇南通人，主任技師，主要從事微生物生理及生物化學(xué)方面的研究。E-mail：hxrwz@163.com