(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南 吉首 416000)

響應(yīng)面優(yōu)化超臨界CO2萃取八月瓜幼果多酚工藝

顧仁勇,楊萬根,余 佶

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南 吉首 416000)

為了綜合利用八月瓜幼果資源，采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取八月瓜多酚。探討了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液作為夾帶劑對多酚的萃取效果，采用響應(yīng)面法，以多酚萃取得率為響應(yīng)值，考察原料與夾帶劑的料液比、萃取壓力和萃取溫度對多酚萃取的影響，并優(yōu)化萃取條件。結(jié)果表明:以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液為夾帶劑，可使八月瓜幼果多酚萃取得率提高約2.45 倍，產(chǎn)品純度提高約15.49%；優(yōu)化所得最佳條件為料液比1∶2.6（g/mL）、萃取壓力37 MPa、萃取溫度51 ℃，此條件下八月瓜幼果多酚萃取得率可達6.41%，產(chǎn)品純度為87.69%。

八月瓜幼果；多酚；超臨界CO2萃??；夾帶劑；響應(yīng)面優(yōu)化法

八月瓜又名八月炸、羊開口、牛腰子果等，植物學(xué)名為三葉木通，是傳統(tǒng)藥食兩用野生植物果實，廣泛分布于我國秦嶺以南的山地、平原及東南亞、日本等地[1-2]。八月瓜果肉營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特[3-4]。研究表明八月瓜對防癌、抗癌、預(yù)防和治療高血壓、高血脂等有顯著效用[5-6]。

湖南西部山區(qū)地理和氣候條件非常適合八月瓜的生長，近幾年，在當(dāng)?shù)卣目茖W(xué)引導(dǎo)和大力推動下，湘西地區(qū)已發(fā)展八月瓜種植近10萬 畝[7]。八月瓜種植期間的蔬果作業(yè)，要摘除大約10%～15%的幼果，大量的幼果直接廢棄，也給環(huán)境造成一定的污染。因此，幼果的綜合利用技術(shù)具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。八月瓜幼果含豐富的多酚類物質(zhì)，植物多酚具有良好的抑菌、抗氧化、清除體內(nèi)自由基、降血壓、防治心腦血管疾病、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種生理和藥理活性，被譽為“第七類營養(yǎng)素”[8-12]。目前，國內(nèi)外有關(guān)植物多酚的提取技術(shù)和功能性研究已開展比較深入[13-16]，但八月瓜多酚的研究尚在起步階段，而八月瓜幼果的多酚提取及綜合利用還未見報道。植物多酚的提取主要有溶劑提取、金屬離子沉淀、樹脂分離法和超臨界萃取等方法[17-19]。其中，超臨界CO2萃取技術(shù)因工藝簡單、無溶劑殘留、萃取高效、產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，在植物多酚的提取中得到了廣泛的應(yīng)用[13]。但是，多酚分子極性強，在CO2流體中的溶解度較低，直接萃取得率低，需要通過添加乙醇等極性夾帶劑加大對酚類的溶解能力，從而提高萃取效果[20-21]。

本研究以乙醇為夾帶劑，超臨界CO2萃取八月瓜幼果中多酚，采用響應(yīng)面法優(yōu)化料液比、萃取壓力和萃取溫度的工藝條件，可為八月瓜幼果多酚提取及綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八月瓜幼果由湘西地區(qū)種植戶提供；CO2（純度99.9%） 岳陽市開誠石化物資有限公司；福林-酚試劑（生物試劑）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；碳酸鈉、無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HA121-50-01型半連續(xù)超臨界CO2萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；F1-130藥物粉碎機 泰斯特儀器有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州亞榮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取操作

將八月瓜幼果切成細條，50 ℃干燥，粉碎過80 目篩，稱取粉料200 g，裝入萃取罐，加夾帶劑浸潤30 min，啟動超臨界CO2萃取裝置萃取多酚。收集產(chǎn)品，按下式計算萃取得率:

1.3.2 多酚含量測定（福林-酚比色法）

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制質(zhì)量濃度0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品樣液，各取1.0 mL，分別加入稀釋2 倍的福林-酚試劑4.0 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.0%的Na2CO3溶液5.0 mL，靜置2 h，用紫外-可見光分光光度計于760 nm波長處測定吸光度[22-23]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)樣品沒食子酸質(zhì)量濃度（Y）與吸光度（A）的線性回歸方程:Y=117.43A-0.018 7（R2= 0.996 4）。

1.3.2.2 產(chǎn)品多酚含量測定

取樣品1.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法處理，用紫外-可見光分光光度計于760 nm波長處測定吸光度，帶入回歸方程計算多酚含量。

1.3.3 夾帶劑對多酚萃取效果的強化實驗

稱取原料200 g加入提取罐，按料液比1∶1.5（g/mL）分別加入無水乙醇和95%、90%、85%、80%乙醇溶液為夾帶劑，浸潤30 min?？刂戚腿毫?0 MPa、萃取溫度45 ℃、CO2流量20 kg/h、萃取時間2.5 h進行多酚萃取，以未加夾帶劑的萃取實驗為對照。計算萃取得率，并測定產(chǎn)品多酚含量為產(chǎn)品純度。

1.3.4 超臨界萃取條件優(yōu)化

在固定CO2流量20 kg/h和萃取時間2.5 h條件下，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以料液比、萃取壓力和萃取溫度為3 個因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以萃取得率為響應(yīng)值，優(yōu)化萃取條件。試驗因素水平見表1。

1.3.5 乙醇提取八月瓜幼果多酚

稱取已粉碎過篩的原料50 g，加95%乙醇溶液400 mL，50 ℃恒溫提取2.5 h，抽濾，收集濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮，收集產(chǎn)品，按1.3.1節(jié)公式計算萃取得率，并測定多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 夾帶劑對多酚萃取效果的強化結(jié)果

由圖1可見，使用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液為夾帶劑，八月瓜幼果多酚的萃取得率為對照組的1.42～2.45 倍，產(chǎn)品純度比對照組提高了4.58%～15.49%，表明使用乙醇為夾帶劑對多酚萃取有明顯的強化效果。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的萃取效果相比，使用95%乙醇溶液和無水乙醇的萃取效果最佳，萃取得率分別達5.21%和5.24%，產(chǎn)品純度分別為86.87%和86.72%，但兩者強化效果相差不大。酚類物質(zhì)分子極性大，在單純的CO2流體中的溶解度有限，通過添加乙醇等極性夾帶劑后能加大對酚類的溶解能力，從而明顯提高萃取效果[21]。考慮經(jīng)濟成本，選擇95%乙醇溶液為夾帶劑進行萃取條件優(yōu)化試驗。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對多酚萃取的影響

固定萃取壓力30 MPa、萃取溫度45 ℃，料液比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0，按1.3.1節(jié)所述方法進行多酚萃取，以萃取得率為評價指標(biāo)，考察萃取效果。

由圖2可見，在料液比1∶0.5～1∶2.5范圍內(nèi)，多酚萃取得率逐漸提高，至1∶2.5時達最高值5.92%。之后隨夾帶劑添加量增大，萃取得率呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，這可能是乙醇加入過多使超臨界CO2流體溶解度飽和所致。因此，最適料液比為1∶2.5。

2.2.2 萃取壓力對多酚萃取的影響

固定萃取溫度45 ℃、料液比1∶2.5，分別控制萃取壓力20、25、30、35、40、45 MPa，按1.3.1節(jié)所述方法進行多酚萃取，以萃取得率為評價指標(biāo)，考察萃取效果。

由圖3可見，隨萃取壓力增大，多酚萃取得率先增加而后降低，壓力為35 MPa時萃取得率達最高值6.32%。增大萃取壓力可增大超臨界CO2流體的密度，從而增大對萃取物的溶解度和減少分子間的傳質(zhì)距離，使萃取得率增加。但壓力過高，溶質(zhì)的擴散系數(shù)減小，傳質(zhì)阻力增大，萃取能力反而下降[24]。選擇最適萃取壓力為35 MPa。

2.2.3 萃取溫度對多酚萃取的影響

固定萃取壓力35 MPa、料液比1∶2.5，萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60 ℃，按1.3.1節(jié)所述方法進行多酚萃取，以萃取得率為評價指標(biāo)，考察萃取效果。

由圖4可見，在35～60 ℃范圍內(nèi)，隨萃取溫度升高，多酚萃取得率先增大后減少，至50 ℃萃取得率達最高值6.41%。萃取溫度升高，一方面因為增加了物質(zhì)的擴散系數(shù)而利于萃取，另一方面則降低了CO2的密度，使物質(zhì)溶解度降低而降低萃取得率[24]。選取最適萃取溫度為50 ℃。

2.3 萃取條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert 8.05軟件進行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理。以料液比、萃取壓力和萃取溫度為3 個試驗因素，根據(jù)單因素試驗結(jié)果選定因素水平，以萃取得率為響應(yīng)值，設(shè)計試驗。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗

對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以多酚萃取得率（Y）為響應(yīng)值的回歸方程:

Y=6.35+0.16A+0.30B+0.17C-0.023AB-0.25AC-0.092BC-0.42A2-0.45B2-0.38C2

由表3可見，所得二次方程模型極顯著，同時失擬項不顯著，表明回歸方程具有顯著意義。方程相關(guān)系數(shù)R2=0.986 9，調(diào)整相關(guān)系數(shù)0.970 1，說明方程能解釋97.01%的響應(yīng)值變化，擬合程度良好，可以用該方程推測試驗結(jié)果。由方差分析可知，3 個因素A、B、C對響應(yīng)值影響極顯著，二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值曲線效應(yīng)影響極顯著，交互項AC對響應(yīng)值曲面效應(yīng)影響極顯著，交互項AB和BC影響不顯著；3 個因素對萃取得率影響的順序為:B＞C＞A，即萃取壓力＞萃取溫度＞料液比。

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖坡度大表明因素對響應(yīng)值影響大，等高線密集呈橢圓形表示兩因素交互影響加大，而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反。

由圖5可見，隨料液比、萃取壓力和萃取溫度水平數(shù)的增大，多酚萃取得率首先明顯增高，隨后緩慢降低，表明3 個因素對萃取得率都具有明顯影響，在所選范圍內(nèi)萃取得率存在極值。圖5a中沿萃取壓力方向比料液比方向的響應(yīng)面坡度大，等高線更加密集，表明萃取壓力對萃取得率的貢獻更大，等高線接近圓形，表明兩因素的交互作用不明顯。同理，圖5b顯示，萃取溫度和料液比對萃取得率的貢獻相差不大，但兩者等高線密集，行狀趨向橢圓，表明兩者交互作用明顯；圖5c顯示，萃取壓力對萃取得率的貢獻要大于萃取溫度，壓力和溫度交互作用不明顯。

2.3.4 萃取條件優(yōu)化及驗證實驗結(jié)果

利用模型優(yōu)化的八月瓜多酚最佳萃取條件為料液比1∶2.57、萃取壓力36.57 MPa、萃取溫度50.74 ℃，預(yù)測八月瓜多酚萃取得率為6.42%?？紤]到實際操作性，將萃取條件修正為:料液比1∶2.6（g/mL）、萃取壓力37 MPa、萃取溫度51 ℃。在此條件下進行驗證實驗，重復(fù)3 次，八月瓜多酚平均萃取得率為6.41%，與預(yù)測值接近，表明優(yōu)化所得條件可靠。 按照1.3.2節(jié)方法測定萃取所得產(chǎn)品多酚含量，重復(fù)3 次，測得產(chǎn)品純度為87.69%。

2.4 乙醇提取八月瓜幼果多酚實驗結(jié)果

用95%乙醇溶液為提取溶劑，于50 ℃恒溫提取八月瓜幼果多酚2.5 h。測定得多酚提取得率為4.37%，產(chǎn)品純度為81.46%，兩項指標(biāo)均低于超臨界CO2萃取結(jié)果，表明采用超臨界CO2萃取八月瓜幼果多酚有明顯的優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液為夾帶劑，能有效強化超臨界CO2萃取八月瓜幼果多酚的萃取效果，使多酚萃取得率提高約2.45 倍，產(chǎn)品純度提高約15.49%。采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以多酚萃取得率為響應(yīng)值，優(yōu)化料液比、萃取壓力和萃取溫度的取值，方差分析顯示所建模型回歸效果極顯著，擬合度良好；料液比、萃取壓力和萃取溫度對多酚萃取得率存在極顯著影響，萃取溫度和料液比之間存在極顯著的交互影響；3 個因素的影響順序為萃取壓力＞萃取溫度＞料液比；優(yōu)化所得最佳條件為料液比1∶2.6、萃取壓力37 MPa、萃取溫度51 ℃，此條件下八月瓜幼果多酚萃取得率為6.41%，產(chǎn)品純度87.69%。

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Optimization of Supercritical CO2Extraction Conditions of Polyphenols from Young Fruits of Holboellio latifolia by Response Surface Methodology

GU Renyong, YANG Wangen, YU Ji
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

Polyphenols were extracted from the young fruits of Holboellio latifolia by supercritical CO2extraction. The effect of ethanol concentration on extraction efficiency was examined. The extraction conditions solid/liquid ratio (namely material/entrainer ratio), extraction pressure and temperature were investigated and the optimum extraction conditions were obtained by response surface methodology. The results showed that the extraction yield and purity of polyphenols were enhanced by 2.45 times and 15.49%, respectively, when using 95% ethanol as the entrainer, in comparison to those obtained without the entrainer. The optimum extraction conditions for solid/liquid ratio, extraction pressure and temperature were 1:2.6 (g/mL), 37 MPa and 51 ℃, respectively. Under these conditions, the extraction yield and purity of polyphenols reached 6.41% and 87.69%, respectively.

young fruits of Holboellio latifolia; polyphenols; supercritical CO2extraction; entrainer; optimization by response surface methodology

TS201.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510015

2014-12-01

顧仁勇(1972—),男,教授,碩士,研究方向為食品加工與保藏。E-mail：gry8565398@163.com