(威爾德(北京)香精有限公司,北京 100176)

同時蒸餾萃取和固相微萃取對雙孢蘑菇風味物質的提取分析

呂艷杰

(威爾德(北京)香精有限公司,北京 100176)

采用同時蒸餾萃取法和固相微萃取法對雙孢蘑菇的揮發(fā)性風味物質進行提取，并通過氣相色譜-質譜聯(lián)用分析及鑒定。采用同時蒸餾萃取法鑒定出36 種化合物，采用固相微萃取法鑒定出34 種風味化合物，2 種方法分析出蘑菇的特征風味物質為1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、2,6-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、1-辛醇等，均以1-辛烯-3-醇含量最高。2 種提取方式相互補充相互驗證。

雙孢蘑菇；同時蒸餾萃?。还滔辔⑤腿?；氣相色譜-嗅聞-質譜聯(lián)用

蘑菇種類繁多，有香菇（Lentinus edodes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、竹蓀（Phallus indusiatus）等。蘑菇風味鮮美，含有豐富的蛋白質、齊全的維生素、真菌多糖和礦物質元素等[1-2]，它的蛋白質含量通常約為干質量的15%～35%，遠高于一般的蔬菜[3]，并且必需氨基酸組成全面，氨基酸模式與人體接近[4]。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是我國培養(yǎng)最廣、產(chǎn)量最大的一種食用菌，也是目前世界上消費量、養(yǎng)殖量最大的食用菌之一[5]。

蘑菇之所以為消費者所喜愛，主要是它具有豐富的營養(yǎng)和特殊的鮮香風味。蘑菇的風味主要來自不揮發(fā)性含氮化合物和揮發(fā)性物質[6]。其獨特的香味則取決于其所含的揮發(fā)性芳香物質[7]。主要包括揮發(fā)性含碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯等[8]。蘑菇的風味非常復雜，不能由單一物質呈現(xiàn)，是多種組分在數(shù)量上平衡的綜合結果[9]。

不同品種的蘑菇，甚至同一蘑菇的不同生長部位，其所含的香味成分也存在差異[10]。鄭建仙等[11-12]用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）法提取分析香菇不同部位的風味成分，從香菇傘部分離鑒定出64 種風味化合物，從香菇柄部分離鑒定出42 種風味化合物，發(fā)現(xiàn)這兩者的風味組成雖有一定差異，但是主要的風味成分（含硫化合物和八碳化合物）差異并不是很大，這一研究為香菇類產(chǎn)品的綜合利用提供了相應的理論依據(jù)。

隨著分離檢測技術的發(fā)展，各種先進的提取分離技術開始應用于蘑菇風味的分析。張書香等[13-14]采用固相微萃?。╯olid phase micro extraction，SPME）技術和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用分析香菇揮發(fā)性香味成分，共檢測出43 種揮發(fā)性風味物質，其中含量較高的成分為二甲基二硫醚（3.36%）、二甲基三硫醚（13.36%）、1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷（3.70%）、1-辛烯-3-醇（1.11%）。GC-MS法也被應用在白靈菇風味成分分析[15]及平菇與香菇揮發(fā)性香味成分的分析[16]等。氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）是利用人的鼻子嗅聞經(jīng)氣相色譜柱分離后的各個餾分，以檢測樣品中的活性風味物質[17]。楊超等[18]運用SDE方法對香竹竹葉中揮發(fā)性物質進行提取，利用GC-O與GC-MS聯(lián)用的法方對其中氣味活性物質進行定性分析，共鑒定出29 種氣味活性物質。目前，國內外對于雙孢蘑菇的研究多集中于對其營養(yǎng)成分如蛋白質、多糖及鮮味成分核苷酸的研究上[19-25]，而對于雙孢蘑菇風味的研究與分析鮮見報道。本實驗利用SDE、SPME對雙孢蘑菇的風味成分進行分析，并利用GC-O-MS對其風味物質進行分析，旨在為雙孢蘑菇風味料的開發(fā)研制提供技術參數(shù)和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（鮮） 市購；無水乙醚、正己烷、無水硫酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；正構烷烴混合標準品（C8～C26） 美國Sigma公司。

1.2 儀器及設備

多功能料理機 九陽股份有限公司；高速冷凍離心機 日本日立公司；同時蒸餾萃取裝置 美國Knotes公司；RV10型旋轉蒸發(fā)儀 德國IKA公司；6890-5973i氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SL型電子天平上海民橋精密科學儀器有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/ PDMS）萃取纖維和手動固相微萃取進樣器、40 mL固相微萃取專用樣品瓶 美國Supelco公司；Sniffer 9 000嗅聞儀 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 SDE法提取雙孢蘑菇揮發(fā)性風味物質樣品制備

準確稱取雙孢蘑菇鮮品100 g，切成約3 cm邊長的小塊，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加500 mL去離子水。裝上SDE裝置，用電熱套加熱，保持蘑菇湯沸騰。另取30 mL無水乙醚溶液和30 mL正己烷溶液加入100 mL的圓底燒瓶中，以水浴鍋加熱，設置初始溫度為30 ℃，待電熱套中大圓底燒瓶中水沸騰再將溫度設置為40 ℃，提取3 h。冷卻至室溫，向有機萃取液中加入適量干燥處理（500 ℃，4 h）的無水硫酸鈉，塞進瓶塞置于冰箱中24 h。

將提取液從冰箱中取出，恢復至室溫后，通過干燥的無水硫酸鈉層過濾至圓底燒瓶中。用旋轉蒸發(fā)儀濃縮（溫度保持在40 ℃）至2 mL左右，然后用分析純N2吹掃至約1 mL待分析。

1.3.2 SPME法提取雙孢蘑菇揮發(fā)性風味物質

準確稱取5.0 g雙孢蘑菇樣品，切丁后裝入40 mL樣品瓶中，在50 ℃的恒溫加熱磁力攪拌器中平衡1 h然后將CAR/PDMS（75 μm）萃取頭插入樣品瓶頂空部分，在60 ℃條件下萃取1 h后撥出，迅速插入GC-MS進樣口，進行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS檢測揮發(fā)性風味物質條件

GC條件:色譜柱:DB-Wax毛細管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣（純度99.99%）氦氣；流量1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃；升溫程序:起始溫度35 ℃，保留5.0 min，以10 ℃/min升至85 ℃，保持1 min；進樣量10 μL；分流比25∶1。

MS條件:電子電離源；離子源溫度220 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍45～500 u；電子能量70 eV。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質的定性和定量分析

揮發(fā)性風味物質定性分析主要依據(jù)GC-MS分析獲得的總離子流色譜圖進行分析鑒定。分離出的風味化合物首先與GC-MS所配備的Wiley 6.0（32萬 個化合物）或NIST 98（10.7萬 個化合物）標準譜庫進行匹配鑒定（要求匹配度不小于80），所得的風味化合物在初步鑒定的基礎上盡可能與正構烷烴混合標準品的保留指數(shù)（retention index，RI）（風味化合物的RI通過正構烷烴混合標準品（C8～C26）計算得到）或文獻中相同化合物的RI進一步確認，檢索確定其化學結構，采用峰面積歸一法確定相應物質中各化合物的相對含量。

1.3.5 特征風味物質的GC-O-MS鑒定

嗅聞口傳輸線溫度250 ℃；火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）和嗅聞口間分流比1∶1；載氣:氮氣；載氣流速1.2 mL/min；進樣量2 μL；不分流模式。

GC-O檢測:分3 個時間段（0～20、20～40、40～60 min）嗅聞，各時間段由3 個不同的感官評價員參與，每個人每個樣品分析3 次，共分析9 次，記錄氣味特征和保留時間。

香味提取稀釋分析:通過調節(jié)FID和嗅聞口間的分流比（1∶1、1∶10……）得到特征風味物質，（分流比是進樣口通過軟件設置），以風味稀釋因子（factor dilution，F(xiàn)D）為指標，F(xiàn)D值越大則表明此風味物質對整體風味的貢獻越大，當FD=1時，則認為此物質對整體風味的影響可以忽略。

2 結果與分析

采用SDE法和SPME法提取雙孢蘑菇中揮發(fā)性風味物質的GC-MS總離子流圖（圖1）。各色譜圖經(jīng)質譜圖人工解析，經(jīng)由GC-MS技術進行風味鑒定，結果如表1、2所示。

其中采用SDE提取雙孢蘑菇獲得的揮發(fā)性風味物質有36 種，檢測出1-辛烯-3-酮（0.30%）、2-甲基-3-辛酮（0.51%）、3-辛烯-2-酮（0.90%）、1-辛烯-3-醇（1.84%）、1-辛醇（0.40%）、2-辛烯-1-醇（0.33%），其中以1-辛烯-3醇含量最高，具有濃郁的蘑菇香味。這些風味物質在蘑菇中相互協(xié)調或者互補，共同組成了蘑菇的特有風味。由GC-MS分析結合不同評價員對雙胞蘑菇的香氣描述以及RI，進一步確認鑒定出:蘑菇香味的5 種化合物，花香的3 種化合物，炒香的2 種化合物，甜香的3 種化合物，果香的2 種化合物，肉香、脂香的2 種化合物，其他的6 種化合物。

采用SPME提取雙孢蘑菇獲得的揮發(fā)性風味物質有34 種化合物。其中癸醛是最重要的風味化合物，相對含量占總風味物質的32.23%。對蘑菇風味影響最重要的八碳化合物，本實驗共檢測出正辛醛（0.31%）、1-辛烯-3-酮（0.48%）、2,3-二辛烯酮（0.63%）、3-辛烯-2-酮（2.14%）、2-辛烯醛（0.90%）、1-辛烯-3-醇（3.22%）、1-辛醇（0.49%）、2-辛烯-1-醇（0.33%）、2-丁基-2-辛烯醛（0.25%），其中以1-辛烯-3-醇含量最高，這與SDE提取雙孢菇揮發(fā)性風味物質的結果一致。其他的一些化合物如2-戊基呋喃具有甘草味或者果香味，2,5-二甲基吡嗪具有爆米花味，2,6-二甲基吡嗪具有巧克力味，對蘑菇風味的形成起著協(xié)調或者互補的作用。由GC-MS分析結合不同評價員對雙胞蘑菇的香氣描述以及RI，進一步確認鑒定出:蘑菇香味的4 種化合物，花香的2 種化合物，炒香的2 種化合物，甜香的2 種化合物，果香的1 種化合物，青草味的2 種化合物，其他的4 種化合物。

采用2 種方法，鑒定出對雙孢蘑菇風味貢獻較大的幾類化合物48 種，其中包括醇類11 種、醛類11 種、酮類13 種、雜環(huán)化合物12 種、酸類1 種。2 種方法均檢測出的物質有21 種，分別是3-甲基丁醛、正己醛、2-戊基呋喃、甲基吡嗪、正辛醛、1-辛烯-3-酮、2,6-二甲基吡嗪、正己醇、壬醛、3-辛烯-2-酮、1-辛烯-3-醇、糖醛、苯甲醛、1-辛醇、2-辛烯-1-醇、苯乙醛、苯乙酮、香葉基丙酮、苯甲醇、2-乙酰吡咯、二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃。

蘑菇中的重要的八碳化合物SDE檢測出6 種，SPEM測得的蘑菇中的八碳化合物有9 種，均以1-辛烯-3醇含量最高。

3 結 論

從表1、2可知，采用SDE方法分離鑒定出的化合物和SPME獲得的揮發(fā)性成分從化合物的總數(shù)上看整體差別不大（SDE獲得揮發(fā)性風味成分化合物36 種，SPME方式獲得34 種），但從分析出的化合物的組成上看差別很大，測定出的共同化合物僅有21 種（但蘑菇中重要的揮發(fā)性的香味物質均測出）。

不同的萃取方式所獲得的揮發(fā)性化合物不盡相同，這是由萃取方法本身的特點所決定的，SDE萃取時間較長，可以把香氣成分最大限度的萃取出來，而SPME是頂空吸附樣品的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分，所以對于半揮發(fā)性的成分的測定靈敏度偏低，同時因為受萃取頭的限制，使用時間長，固定液流失，吸附力隨之下降，從定量上講也要弱于SDE的方式。而從定性來講，SPME法由于其簡單無破壞的特點對于揮發(fā)性化合物的鑒定更準確，SDE法具有良好的重復性和較高的萃取量，適合于香精香味成分的定量分析；SDE法具有快速簡便、不使用溶劑和樣品檢測非破壞性等優(yōu)點，適合于香精的剖析定性[26]。所以實驗采用的2 種提取方式是相互補充相互驗證。

以SDE和SPME 2 種提取方式分離出雙孢蘑菇的香味物質并進行了分析，為雙孢蘑菇香味物質在生產(chǎn)上的應用提供了可靠地數(shù)據(jù)參考。然而由于時間和條件的限制，實驗中仍存在一些問題需要深入研究。

[1] 李萬德, 章成林. 淺談食用菌的營養(yǎng)與藥用價值[J]. 湖北生態(tài)工程職業(yè)技術學院學報, 2005(1): 11-13.

[2] 陳海強, 胡汝曉, 彭運祥, 等. 食用菌鮮味物質的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2011, 11(19): 3783-3786.

[3] 劉宏. 食用菌營養(yǎng)價值及開發(fā)利用[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2007, 13(12): 25-27.

[4] OUZOUNI P K, PETRIDIS D, KOLLER W D. Nutritional value and metal content of wild edible mushrooms collected from West Macedonia and Epirus, Greece[J]. Food Chemistry, 2009, 115(4): 1575-1580.

[5] MATTILA P, SUONP?? K, PIIRONEN V. Functional properties of edible mushrooms[J]. Nutrition, 2000, 16(7/8): 694-696.

[6] 高新強. 蘑菇的風味物質[J]. 食用菌, 1985(4): 44-45.

[7] 溫泉, 王錫昌. 食用菌風味物質的研究及應用進展[J]. 長江大學學報, 2006, 3(4): 211-229.

[8] HANSEN H P, KLINGENBERG A. Detemination of somen important flavor compounds in commercia mushroom concentrates[J]. Z Lebensm Unters Forsch, 1983, 177: 333-335.

[9] BELUHAN S, RANOGALEC A. Chemical composition and nonvolatile components of Groatian wild edible mushrooms[J]. Food Chemistry, 2011, 124: 1076-1082.

[10] HUSSON F, KRUMOV K N, ELIAN C, et al. Influence of medium composition and structure on the biosynthesis of nature flavor 1-octen-3-ol by Penicillium camemberti[J]. Progress Biochemistry, 2005, 40: 1359-1400.

[11] 鄭建仙, 丁霄霖. 福建香菇風味的檢測[J]. 無錫輕工大學學報, 1995, 14(2): 102-108.

[12] 鄭建仙. 福建香菇風味物質的分離與鑒定[J]. 中國食用菌, 1995, 14(6): 211-229.

[13] 張書香. 香菇香味的分析及香菇香精的熱反應制備工藝[D]. 北京:北京工商大學, 2010.

[14] 張書香, 謝建春, 孫寶國. 固相微萃取/氣-質聯(lián)用分析香菇揮發(fā)性香味成分[J]. 北京工商大學學報, 2010, 28(2): 1-5.

[15] 李曉燕, 蘭蓉, 吳志明, 等. 白靈菇風味成分的GC-MS分析[J]. 中國食用菌, 2009, 28(2): 36-38.

[16] 李秦, 海洋, 師會勤, 等. 平菇與香菇揮發(fā)性香氣成分的GC-MS分析比較[J]. 中化學與生物工程, 2010, 27(2): 87-89.

[17] 艾有偉. 香菇和平菇酶解特性研究及產(chǎn)品制備[D]. 武漢: 武漢工業(yè)學院, 2012.

[18] 楊超, 張海靜, 楊旭, 等. GC-O與GC-MS聯(lián)用法鑒定香竹竹葉中關鍵氣味活性物質[J]. 竹子研究匯刊, 2009(4): 31-37.

[19] 季云琪. 雙孢蘑菇鮮味劑的提取研究[D]. 濟南: 山東輕工業(yè)學院, 2012.

[20] 王小紅, 張衛(wèi)明, 錢驊, 等. 雙孢蘑菇中核苷酸的測定及酶解條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(9): 171-174.

[21] 王小紅, 錢驊, 張衛(wèi)明, 等. 雙孢蘑菇中核苷酸提取的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(4): 216-219.

[22] MAHMUDUL I N, BIAN Y B. Differentiation of homokaryons and heterokaryons of Agaricus bisporus and Lecanicillium fungicola[J]. Microbiological Research, 2011, 166(3): 226-236.

[23] TIM M B, MARESH M K. Water potential and soluble carbohydrate concentrations in tissues of freshly harvested and stored mushrooms (Agaricus bisporus)[J]. Postharvest Biology and Technology, 2001, 22(2): 121-131.

[24] 郭云霞, 秦俊哲, 陳均志, 等. 酶法研制蘑菇調味汁工藝的研究[J].陜西科技大學學報, 2011, 29(1): 54-57.

[25] 何飛, 駱毅, 邵超群, 等. 酸性蛋白酶和纖維素酶聯(lián)合水解蘑菇梗蛋白的研究[J]. 中國調味品, 2010, 35(11): 51-54.

[26] 呂鍵, 阮曉明, 盛志藝, 等. 固相微萃取與同時蒸餾萃取法分析香精成分比較[J]. 煙草科技, 2003(2): 25-28.

Comparative Application of SDE and SPME for Analysis of Aroma-Active Compounds in Button Mushroom (Agaricus bisporus)

L? Yanjie
(Wild Flavors (Beijing) Co. Ltd., Beijing 100176, China)

Aroma-active compounds in Agarucs bisporus were isolated by simultaneous distillation extraction (SDE) or solid phase micro extraction (SPME) and analyzed by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS). A total of 36 and 34 kinds of aroma-active compounds were identified by SDE and SPME, respectively. The following characteristic flavor compounds were identified: 1-octene-3-ol, 1-octene-3-one, 2-octene-1-ol, 2,6-dimethyl pyrazine, 2-pentyl furan, methyl pyrazine, n-octanol etc. 1-Octene-3-ol was identified by both methods as the most abundant compound. The two extraction methods can be used to complement and validate each other.

Agaricus bisporus; simultaneous distillation extraction (SDE); solid phase micro extraction (SPME); gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry (GC-O-MS)

TS255.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510037

2014-11-25

呂艷杰(1977—),女,工程師,碩士,研究方向為食品添加劑。E-mail：roc530@sohu.com