LAM單獨(dú)及與ECV聯(lián)合治療CHB對不同基因型HBV耐藥突變的影響

趙帥,孫靜娜，白雪梅，李彥明，耿玉蘭，劉榮欣

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊 050031)

摘要：目的探討拉米夫定(LAM)單獨(dú)及與恩替卡韋(ECV)聯(lián)合治療慢性乙型肝炎(CHB)對不同基因型HBV耐藥突變的影響。方法選擇CHB患者100例，其中B基因型30例，C基因型70例。將患者隨機(jī)分為聯(lián)合用藥組及單獨(dú)用藥組各50例，聯(lián)合用藥組每日口服LAM 50 mg和ECV 0.5 mg，單獨(dú)用藥組每日單用LAM 100 mg。治療后24個(gè)月采用PCR-反向點(diǎn)雜交芯片法檢測血清HBV基因型耐藥突變情況及耐藥基因變異類型。結(jié)果 聯(lián)合用藥組檢出耐藥突變4例，檢出率為8%，其變異類型分別為rtT184L+L180M+M204V、rtT184L+S202G+L180M+M204I、rtM250L+M204I，其中C基因型3例(突變率為9.1%)，B基因型1例(突變率為5.9%)；單獨(dú)用藥組檢出耐藥突變25例，檢出率為50%，其變異類型分別為rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtM204I，其中C基因型18例(突變率為48.6%)，B基因型7例(突變率為53.8%)。兩組耐藥突變檢出率比較，P<0.05，兩組B型和C型基因的耐藥突變率比較均無顯著性差異。結(jié)論 LAM單用治療CHB的耐藥突變檢出率明顯高于與ECV聯(lián)合治療者，LAM單用及與ECV聯(lián)合治療對CHB不同基因型HBV耐藥突變無明顯影響。

關(guān)鍵詞：慢性乙型肝炎；聯(lián)合用藥；恩替卡韋；拉米夫定；基因型；RT 區(qū)位點(diǎn)變異

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.002

中圖分類號：R512.62 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳科研立項(xiàng)課題(20130565)。

作者簡介：第一趙帥(1982-)，女，主管檢驗(yàn)師，在讀研究生，主要研究方向?yàn)椴《拘愿窝椎膶?shí)驗(yàn)室研究。E-mail：767597129@qq.com

作者簡介：通信劉榮欣(1972-)，女，副主任檢驗(yàn)師，碩士，主要研究方向?yàn)榕R床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。 E-mail：445306720@qq.com

收稿日期：(2015-07-25)

Influence of LAM or LAM combined with ECV treatment on drug-resistant

gene mutations of different HBV genotypes in patients with CHB

ZHAOShuai,SUNJing-na,BAIXue-mei,LIYan-ming,GENGYu-lan,LIURong-xin

(TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the drug-resistant gene mutations of different HBV genotypes of patients with chronic hepatitis B (CHB) after treatment of lamivudine (LAM) or the combined treatment of entecavir (ECV) and LAM. MethodsOne hundred CHB patients with 30 cases of genotype B and 70 cases of genotype C were randomly divided into two groups: the combination group and the single-drug group, 50 patients in each group. The combination group was treated with 50 mg LAM and 0.5 mg ECV everyday orally. The single-drug group was treated with 100 mg LAM orally. After a 24-month-treatment, we detected HBV genotype and gene mutations by PCR-RD blot. ResultsIn the combination group, 4 cases (8%) of resistance gene mutations were detected with the types of rtT184L+L180M+M204V, rtT184L+S202G+L180M+M204I and rtM250L+M204I, and there were 3 cases (mutation rate 9.1%) of genotype C and 1 case (5.9%) of genotype B. In the single-drug group, 25 cases (50%) of resistance gene mutations were detected with the types of rtL180M+M204V, rtL180M+M204I and rtM204I, and there were 18 cases (48.6%) of genotype C and 7 cases (53.8%) of genotype B. Significant different was found in the rate of drug-resistant mutation between the two groups (P<0.05). There was no significant difference in the rate of drug resistance mutation of genotypes B and C between the two groups. ConclusionsThe detection rate of drug-resistant mutation was significantly lower in treatment with LAM combined with ECV than that in treatment with LAM. The treatment with only LAM or LAM combined with ECV had no effect on drug-resistant gene mutations of different HBV genotypes in pationts with CHB.

Key words: chronic hepatitis B; drug combination; entecavir; lamivudine; genotype; RT location mutations

目前我國被乙肝病毒(HBV)感染的人數(shù)約占全球總患者的三分之一，由此引起的慢性乙型肝炎(CHB)嚴(yán)重威脅我國人口的身體健康，核苷類藥物是治療CHB的最常見手段，有研究[1]指出，由該類藥物引起的耐藥基因位點(diǎn)變異正在逐漸增多。2012年1月～2013年12月，我們檢測了100例CHB患者恩替卡韋(ECV)聯(lián)合拉米夫定(LAM)治療24個(gè)月后血清基因型及HBV反轉(zhuǎn)錄(RT)區(qū)耐藥突變率和突變類型，并分析了聯(lián)合用藥在CHB治療和轉(zhuǎn)歸中預(yù)防或降低耐藥率的有效性，以期為臨床長期治療CHB患者及優(yōu)化治療方案提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料選取我院2012年1月～2013年12月治療前HBV DNA為陽性且未檢測出RT區(qū)位點(diǎn)變異的CHB患者100例，男62例、女38例，年齡18～54歲。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2009年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)會、肝病學(xué)分會制定的《全國病毒性肝炎防治方案》，其中B基因型30例，C基因型70例。將患者隨機(jī)分為聯(lián)合用藥組及單獨(dú)用藥組各50例，兩組一般資料具有可比性。

1.2治療方法聯(lián)合用藥組每日口服LAM 50 mg和ECV 0.5 mg，單獨(dú)用藥組每日單用LAM 100 mg。共治療24個(gè)月，治療期間不加用其他抗HBV藥物和保肝藥物。

1.3HBV基因型及RT區(qū)位點(diǎn)變異檢測隔夜空腹10 h采集患者靜脈血3 mL于真空采血管中，室溫凝集，3 500 r/min離心后取上清，-80 ℃儲存。采用PCR-反向點(diǎn)雜交芯片法檢測HBV基因型、RT區(qū)(rtL180M、rtT184L、rtM204V、rtM204I、rtS202、rtM250)位點(diǎn)變異，檢測儀器為YN-H16雜交儀和BYQ6056E-298擴(kuò)增儀，試劑購自深圳亞能生物有限公司。所有操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，同期室內(nèi)質(zhì)控合格。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1聯(lián)合用藥組基因型和RT區(qū)變異類型 聯(lián)合用藥組50例患者中檢出HBV耐藥基因突變4例，33例C基因型患者中檢出3例耐藥突變，突變率9.1%，其中2例變異類型為rtT184L+L180M+M204V、1例為rtT184L+S202G+L180M+M204I；17例B基因型患者中檢出1例耐藥突變，突變率5.9%，其變異類型為rtM250L+M204I，B、C基因型突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(校正χ2=0.02，P>0.05)。

2.2單獨(dú)用藥組基因型和RT區(qū)變異類型單獨(dú)用藥組50例患者中檢出HBV耐藥基因突變25例，37例C基因型患者中檢出18例耐藥突變，突變率48.6%，其中變異類型分別為5例rtL180M+M204V、4例rtL180M+M204I、9例rtM204I；13例B基因型患者中檢出7例耐藥突變，突變率53.8%，其中2例變異類型為rtL180M+M204V、2例rtL180M+M204I、3例rtM204I。B、C基因型突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.10，P>0.05)。

2.3聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組突變率比較 聯(lián)合用藥組檢出HBV耐藥基因突變4例，突變率8%；單獨(dú)用藥組檢出HBV耐藥基因突變25例，突變率50%，聯(lián)合用藥組突變率明顯低于單獨(dú)用藥組(χ2=21.42，P<0.01)。

3討論

CHB患者長期服用核苷類似物藥物可致乙肝病毒RT區(qū)基因突變和耐藥性的發(fā)生。LAM是臨床治療CHB患者應(yīng)用最廣泛的胞嘧啶核苷類似物，但長期使用可引起乙肝病毒耐藥基因位點(diǎn)的突變，影響治療效果[2]。LAM治療最為常見的耐藥位點(diǎn)主要是引起HBV P基因區(qū)180位點(diǎn)或204位點(diǎn)發(fā)生突變，5年耐藥率為60%～70%[3]。ECV對HBV DNA復(fù)制的起始、逆轉(zhuǎn)錄和DNA正鏈合成3個(gè)階段均起抑制作用，在有效改善機(jī)體T細(xì)胞亞群免疫功能的同時(shí)，能顯著抑制HBV DNA復(fù)制，降低患者體內(nèi)病毒載量[4]。Ye等[5]發(fā)現(xiàn)，LAM耐藥的常見突變位點(diǎn)為rtM204和rtL180，經(jīng)ECV補(bǔ)救治療后增加出現(xiàn)rtT184、rtS202或rtM250等位點(diǎn)的突變，本研究中HBV基因位點(diǎn)變異與此一致。有研究[6，7]結(jié)果顯示，LAM耐藥后會導(dǎo)致HBV對ECV的敏感性明顯下降，使治療出現(xiàn)耐藥基因突變后的挽救措施越來越困難。目前聯(lián)合治療乙型肝炎已逐漸被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和認(rèn)可，國外研究[8]顯示，LAM聯(lián)合ECV用藥可使肝臟炎癥在早期得到控制、對肝纖維化的出現(xiàn)起到預(yù)防干預(yù)及延緩逆轉(zhuǎn)的作用，聯(lián)合用藥存在優(yōu)勢，療效更佳。

楊瑞鋒等[9]研究顯示，DNA微陣列芯片法檢測HBV耐藥突變有很好的準(zhǔn)確性，檢測結(jié)果與克隆測序完全符合率達(dá)95.5%。本研究采用DNA微陣列芯片法檢測了CHB患者治療后24個(gè)月時(shí)的基因型和RT區(qū)(rt180M、rt184L、rt204V、rt204I、rtS202、rtM250)變異位點(diǎn)，聯(lián)合用藥組檢出耐藥突變4例，其變異類型分別為rtT184L+L180M+M204V、rtT184L+S202G+L180M+M204I、rtM250L+M204I，其中C基因型3例，B基因型1例；單獨(dú)用藥組檢出耐藥突變25例，其變異類型分別為rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtM204I，其中C基因型18例，B基因型7例。薛瑞霞等[10]研究顯示B、C基因型在我國CHB患者中為主要出現(xiàn)的基因型，ECV多為LAM耐藥后補(bǔ)救用藥，其引起的變異類型為rtM204V+rtL180M+rtT184L，是目前我國ECV耐藥的主要變異類型，此結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

聯(lián)合用藥組C基因型患者耐藥突變率為9.1%，B基因型患者耐藥突變率為5.9%，兩種基因型間的突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；單獨(dú)用藥組C基因型突變率為48.6%，B基因型耐藥突變率為53.8%，兩種基因型間的突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組B型和C型基因的耐藥突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。崔艷等[11]研究發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)HBV基因型以B型和C型為主，YMDD突變發(fā)生率在B、C基因型間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)C基因型中rtLl80M、M204V/I、rtT184L、S202G突變明顯高于B基因型，C基因型中未見rtM250L點(diǎn)突變，此位點(diǎn)變異僅見于B基因型。由于本研究樣本量有限，同時(shí)僅檢測了已知位點(diǎn)的耐藥突變，所以需加大樣本量予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究LAM與ECV聯(lián)合應(yīng)用治療CHB患者24個(gè)月的耐藥率為8%,遠(yuǎn)低于單用LAM的50%，兩者聯(lián)合應(yīng)用能大大降低單獨(dú)用藥的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)了長期用藥的可能。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)基因分型，動態(tài)檢測耐藥突變結(jié)果，為CHB患者及時(shí)調(diào)整適合的治療方案。

綜上所述，LAM單用及與ECV聯(lián)合治療對CHB不同基因型HBV耐藥突變無明顯影響，LAM與ECV聯(lián)合治療CHB的耐藥突變檢出率明顯低于單用LAM治療者。

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