楊國宗綜述，楊麗陽審校

(漳州市中醫(yī)院檢驗科，福建 漳州363000)

近年來，隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活方式的改變，2型糖尿病(T2DM)發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。T2DM是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳的復(fù)雜性疾病，并以胰島素分泌受損和(或)胰島素抵抗為主要的臨床特點，其遺傳方式屬于常染色體多基因隱性遺傳，由于異?；虻倪z傳使后代具有糖尿病易感性。隨著單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析技術(shù)的發(fā)展以及全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果的相繼報道，至今已發(fā)現(xiàn)許多常見基因變異與T2DM密切相關(guān)，但其病因、發(fā)病機制未能完全闡明。據(jù)統(tǒng)計，目前全球糖尿病患者約3.66億，估計到2030年將有5.52億，其中T2DM 至少占95%以上[1]，因此利用高效率、高通量、低成本的SNP分析技術(shù)來發(fā)現(xiàn)糖尿病易感基因并對其進行相關(guān)研究，為T2DM的早期預(yù)測并及時做好防治措施具有非常重要的意義。我們以SNP為線索，將其在T2DM發(fā)病機制研究中的應(yīng)用進展作一綜述。

1 SNP概況

SNP是指由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在遺傳學(xué)分析中，SNPs作為第三代遺傳標記，在科研中得以廣泛應(yīng)用。人類染色體大量存在SNP位點，近年來的研究發(fā)現(xiàn)有些SNP引起包括糖尿病、腫瘤等在內(nèi)的各種疾病相關(guān)基因表達,有些SNP不直接導(dǎo)致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病的致病基因相鄰，也可以作為某些疾病的重要標記，由于存在著 SNP，造成人類對有些疾病的易感性、對藥物反應(yīng)性及耐受性的個體差異。另外，SNP具有的高頻性、穩(wěn)定性特征對疾病發(fā)生的相關(guān)因素分析也是非常重要[2]。隨著現(xiàn)代技術(shù)的進步，利用SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變比通過家系遺傳譜的研究容易得多。由于SNP主要是二等位多態(tài)性，在基因組篩選中SNPs只需+/-的分析，而不必分析片段的長度，這有利于篩選或檢測SNPs的自動化，達到快速、規(guī)?；Y查的目的。SNPs在人群中幾乎為雙等位基因標記，其等位基因頻率容易估計，同時也易于進行基因分型方面研究。

2 SNP的主要檢測平臺

2.1 低通量 包括限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、DNA 測序法、變性高效液相色譜(DHPLC)等，其中以DHPLC技術(shù)為主要代表，它是在單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，其主要原理是先對目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性后，含有突變的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，通過帶正電荷的流動相將帶負電荷的DNA分子吸附到固定相上，在不完全變性的條件下，含錯配堿基的雜合異源雙鏈比完全配對的同源雙鏈和固定相的親和力弱，更易從分離柱上洗脫下來，從而達到分離的目的。實驗樣本中SNPs是否存在，則最終表現(xiàn)為色譜峰形或數(shù)目差異，進而檢測目的DNA的堿基變異，一般與直接測序法合用。在臨床應(yīng)用過程中，DHPLC技術(shù)篩查未知SNPs具有檢測效率高、成本低、易于操作和快速準確等優(yōu)點，因此在人功能基因SNPs研究中得到較好應(yīng)用[3]。值得注意的是，DHPLC檢測也有一些不足，首先是對所用的試劑和環(huán)境要求較高，容易產(chǎn)生誤差；其次，該技術(shù)不能檢測出純合突變。總的來說，該技術(shù)很大地促進了新突變位點的發(fā)現(xiàn)，并對了解疾病發(fā)生發(fā)展機制，確定藥物研發(fā)方向做出了重要貢獻。

2.2 中高通量 主要有SNPstream技術(shù)、SNP lexTM Assay、基因芯片技術(shù)、MassARRAY-IPLEX技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)有著信息量大、自動化、成本低、有一定的特異性等優(yōu)點，但其檢測靈敏度低、重復(fù)性較差、分析范圍窄等不足。MassArray飛行時間質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)是為基因組學(xué)研究提供兼顧靈敏度和特異性的中高通量技術(shù)平臺，是目前唯一采用質(zhì)譜法進行直接檢測的設(shè)備。MassARRAY-IPLEX SNP檢測系統(tǒng)基本原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)技術(shù)[4]，該技術(shù)是Sequenom公司推出的世界領(lǐng)先的基因分析工具，通過引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)基因分型檢測，分型結(jié)果準確性高，因此在SNP的基因分型具有重要的意義。其主要特點是序列特異引物在SNP位點上延伸1個堿基，然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)瞬時納秒強激光激發(fā)，基質(zhì)將吸收的激光脈沖能量轉(zhuǎn)移給待分析樣品，按質(zhì)荷比加以分離。離子捕獲儀收集并儲存脈沖信號，并對其進行質(zhì)譜分析，通過比較A、T、G和C的信號強度及毗鄰信號間分子量差異可得出模板序列的一維信息，從而實現(xiàn)SNP分型的目的。MassARRAYTM系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，不需要各種標記物，其采用的高密度SpectroCHIPTM點陣芯片可以快速完成多重性鑒定，具有很大的靈活性，高度的準確性，在大量樣本的高通量檢測中得到較廣的應(yīng)用[5]。

2.3 高通量 包括高溫連接酶檢測反應(yīng) (LDR)、Taqman探針技術(shù)、高分辨熔解曲線(HRM)基因突變檢測/分型系統(tǒng)等。新型LDR寡核苷酸芯片利用了LDR原理，即當高溫連接酶檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應(yīng)處存在著基因點突變類型的堿基錯配時連接反應(yīng)就不能進行，從而實現(xiàn)對基因多態(tài)性位點的識別。利用該原理，該技術(shù)大大提高了分型準確性，從而使得T2DM易感基因分型得到更好的應(yīng)用。Taqman探針技術(shù)也是目前應(yīng)用較為廣泛的一種分析技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點在于反應(yīng)在PCR過程中進行，無需分離或洗脫過程，從而減少了可能的PCR污染。此外，擴增產(chǎn)物分析具有簡便、快捷、準確、無需電泳，提高了實驗速度。HRM基因突變檢測/分型系統(tǒng)在5分鐘即可完成96/384孔板PCR產(chǎn)物樣品突變檢測，尤其用于測序前的大規(guī)模突變篩查及基因分型工作，使測序的工作量降低為原來的1%。

3 SNP在T2DM易感基因篩選中的應(yīng)用

目前，國際上共報告了40多個糖尿病易感基因。Scott LJ等[6]通過對SNPs的關(guān)聯(lián)分析后，發(fā)現(xiàn)了4個與T2DM有關(guān)的易感基因，它們分別是定位在9號染色體上的CDKN2A、CDKN2B基因，以及定位在 3號染色體上的 IGF2BP2、CDKALl基因。我國也開展了相關(guān)易感位點的研究，報告了幾個候選易感基因。早在2003年，駱天紅等[7,8]通過收集大量T2DM患病同胞家系，利用人類多態(tài)性研究中心公布的微衛(wèi)星位點，對這些家系進行全基因組掃描和連鎖分析，發(fā)現(xiàn)了中國漢族人T2DM的一些易感基因位點，他們還對102個華東地區(qū)漢族人T2DM家系 (其中包括糖尿病患者282人，74個家系有2個糖尿病同胞，18個家系有3個糖尿病同胞，10個家系有4個糖尿病同胞)的SNP關(guān)聯(lián)分析和全基因組掃描研究，結(jié)果顯示這些人的9號染色體上D9S171、D9S175同T2DM有連鎖傾向。Wen J等[9]也證實了以往發(fā)現(xiàn)的另外6個T2DM易感基因，分別是 TCF7L2、SLC30A8、HHEX、PPARG、KCNJl、FTO 基 因 ， 這 些 基 因 與T2DM發(fā)生和發(fā)展的風險性增高相關(guān)。后來，我國有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)SLC30A8基因與中國漢族人T2DM和空腹血糖受損及糖調(diào)節(jié)受損相關(guān)，SLC30A8基因CC基因型患T2DM的風險顯著增加[10,11]。對于血糖的調(diào)節(jié)因子胰島素及其受體的相關(guān)基因研究中，Malecki等[12]人發(fā)現(xiàn)2號染色體長臂近末端處D2S126附近的糖尿病候選基因NEURODl雜合突變同T2DM相關(guān)，該基因編碼的蛋白同HLH蛋白E47形成異二聚體后，可同胰島素基因啟動子上的E-box序列結(jié)合，從而調(diào)控胰島素的分泌。另一個重要的候選基因胰島素受體底物1基因，由于該基因編碼的蛋白質(zhì)在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，其某些特殊等位基因同T2DM相關(guān)。糖代謝中與血脂轉(zhuǎn)化因素相關(guān)基因研究中，焦紅肖[13]等對天津地區(qū)1463名無血緣關(guān)系的人群研究發(fā)現(xiàn)了5個SNP位點與T2DM顯著相關(guān)，分別為 CDKN2A/B、CDKAL1、LPHN3、IGF2BP2、ABCG2基因。孫志連[14]等對T2DM患者的脂聯(lián)素基因第45位點單核苷酸多態(tài)性(SNP45)分析發(fā)現(xiàn)糖尿患者群中G等位基因多見，攜帶等位基因G的患者血清甘油三脂較高，提示脂聯(lián)素基因SNP45多態(tài)性與T2DM發(fā)病及甘油三脂有關(guān)。韓景銀[15]等研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者存在血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素水平的異常表達，與T2DM頸總動脈IMT值有著顯著相關(guān)性。

近年來，SNP在T2DM腎病的易感性方面的相關(guān)研究比較多。T2DM并發(fā)腎病的相關(guān)易感基因的研究主要針對T2DM患者微血管病變的各高危因子，包括糖、脂代謝異常相關(guān)基因，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的基因及其他遺傳因素。Gosek K等[16]研究了444例T2DM患者，發(fā)現(xiàn)AR基因C-106T多態(tài)性是血糖控制不良T2DM腎病的危險因子。McKnight AJ等[17]研究了GREM1基因變異與DN的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GREM1變異型rs1129456與糖尿病腎病相關(guān)。Naresh VV等[18]研究了ACE基因I/D多態(tài)性與T2DM腎病關(guān)系，研究結(jié)果顯示DD純合型與2型糖尿病腎病有關(guān)。李頎等[19]對脂氧合酶超家族成員之一ALOX12的基因多態(tài)性進行研究，在北方漢族人群中未發(fā)現(xiàn)ALOX12基因多態(tài)性與T2DM、DN有關(guān)。所研究這些可能的易感基因，還有待進一步確定。目前對于T2DM及DN候選基因的研究中存在一部分有爭議或矛盾的結(jié)論，原因可能與采集的樣本過小、種族不同、地域不同、樣本不同質(zhì)性、技術(shù)方法不同有關(guān)。

總之，隨著高效、高通用、低成本的SNP檢測技術(shù)不斷被開發(fā)和大規(guī)模應(yīng)用，不同地區(qū)不同種族人群的SNPs研究增多，使SNPs數(shù)據(jù)庫的日趨健全，越來越多與T2DM相關(guān)的SNPs被發(fā)現(xiàn)及T2DM易感基因被確認，將有助于對T2DM及DN發(fā)病機制的深入了解。通過先進的高通量分析技術(shù)對T2DM患者SNP檢測的應(yīng)用，有助于建立疾病基因分型方法為T2DM的預(yù)防提供理論依據(jù)，以便早期發(fā)現(xiàn)T2DM高危人群，為T2DM患者提供新的預(yù)防和治療選擇,同時對實現(xiàn)DN早期預(yù)測和防治也具有重要意義。

[1]Whiting DR,Guariguata L,Weil C,et al.IDF diabetes atlas:global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract,2011,94(3):311-321.

[2]Mullikin JC,Hunt SE.Cole CG,et a1.An SNP map of human chromosome 22[J].Nature,2000,40(7):516-520.

[3]Matyas G,De Paepe A,HanidaIyd,et a1.Evaluation and application of denaturing HPLC for mutation detection in madman syndrome:identification of 20 novelmutations and two nova l polymorphisms in the FBN1 gene[J].Hum Mutat 2002,19(5):443-456.

[4]Griffin TJ,Smith LM.Single-nucleotide polymorphism analysis by MALDI-TOFmass spectrometry[J].Trends Biot echnol,2000,18(1):77-84.

[5]Meyer K，Ueland PM.Use ofmatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry for multiplex genotyping[J].Adv ClinChem,2011,53(1):1-29.

[6]Scott LJ,Mohlke KL,Bonnycastle LL,et al.A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detectsmultiple susceptibility variants[J].Science,2007,316(5829):1341-1345.

[7]駱天紅、趙萸、袁文韜，等.部分基因組掃描研究2型糖尿病易感基因座位的初步報告[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2000,16(3):160－163.

[8]Yan D,Guo L,Tianhong L,et al.Association of phosphor enolpyruvate carboxykinase gene polymorphism with Chinese type 2 diabetes[J].Chin JEndocrinol Metab,2003,19(5):368-370.

[9]Wen J,Ronn T,Olsson A,et al.Investigation of type 2 diabetes risk alleles support CDKN2A/B,CDKAL1,and TCF7L2 as susceptibility genes in a Han Chinese cohort[J].PLoSOne,2010,5(2):9153.

[10]Wu Y，Li H,Lin X,et a1.Common variants in CDKALl.CDKN2A/B.IGF2BP2.SLC30A8.and HHEX/IDE genes are associated with type 2 diabetes and impaired fasting glucose in a Chinese Han population[J].Diabetes,2008,57(10):2834-2842.

[11]Xiang J,Li XY,Xu M，et a1.Zinc transporter-8 gene(SLC308 A)is associated with type 2 diabetes in Chinese[J].JClin Endocrinal Metal 2008,93(10):4107-4112.

[12]MaleckiMT,Cyganek K,Klupa T,et al.The Ala45 Thr polymorphism of BETA2/NeuroD1 gene and susceptibility to type 2 diabetesmellitus in a Polish population[J].Acta Diabetes,2003,40(2):109-111.

[13]焦紅肖,蔡春友,魏鳳江,等.中國人群2型糖尿病相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析及基因型交互作用研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,19(1):6-12.

[14]孫志連,李彩萍,呼日勒特木爾,等.脂聯(lián)素基因多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素抵抗相關(guān)因素研究 [J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,36(4):348-350.

[15]韓景銀,楊文東.血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素水平與T2DM患者頸總動脈IMT的相關(guān)性研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(1):34-35.

[16]Gosek K,Moczulski D,Zukowska-Szczechowska E,et al.C-106T polymorphism in promoter of altose reductase gene is a risk factor for diabetic nephropathy in type 2 diabetes patients with poor glycogenic control[J].Nephron Exp-Nephrol,2005,99(3):63-67.

[17]McKnight AJ,Patterson CC,Pettigrew KA,et al.A GREM1 gene variant associates with diabetic nephropathy[J].JAm Soc Nephrol,2010,21(5):773-781.

[18]Naresh VV,Reddy AL,Sivaramakrishna G,et al.An giotensin conver-ting enzyme gene polymorphism in type II diabetics with nephropathy[J].Indian JNephrol,2009,19(4):145-148.

[19]李頎,王巖,邱一凡,等.ALOX12基因多態(tài)性與糖尿病和糖尿病腎病的相關(guān)性研究[J].檢驗醫(yī)學(xué),2014,29(3):219-225.