張妍妍 李思佳

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·150040）

羊芪通絡(luò)膠囊由淫羊藿、黃芪、麻黃、穿山龍、延胡索等藥味組成。具有溫經(jīng)散寒，通絡(luò)止痛之功效。用于寒濕閉阻經(jīng)絡(luò)所致的痹病，癥見腰脊疼痛、四肢關(guān)節(jié)冷痛；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎見上述證候者。為控制制劑質(zhì)量，對其進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

1 儀器與試藥

Agilentl200高效液相色譜儀(安捷倫公司)。ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech)。Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱。羊芪通絡(luò)膠囊由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供（批號：20140601、20140602、20140603；規(guī)格：每粒含膠囊內(nèi)容物0.28g），鹽酸麻黃堿（批號714-8501）、黃芪甲苷（批號0781-200109）、淫羊藿苷（批號0734-9508）、延胡索乙素（批號110726-200409）、薯蕷皂苷元（批號1539-200001）均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 淫羊藿薄層色譜鑒別[1]取本品膠囊內(nèi)容物10g，加乙醇60ml，超聲處理20分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》一部附錄VI B）試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各5～10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（10:1:1.5:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性樣品無此斑點。

2.1.2 麻黃薄層色譜鑒別[2]取本品膠囊內(nèi)容物6g，加濃氨試液數(shù)滴，再加三氯甲烷60ml，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各5～10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（20:5:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點，而陰性樣品無此斑點。

2.1.3 穿山龍薄層色譜鑒別[2]取本品膠囊內(nèi)容物5g，加甲醇80ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加3mol/L鹽酸溶液50ml使溶解，置水浴中加熱水解30分鐘，放冷，再加入三氯甲烷50ml，加熱回流15分鐘，濾過，取三氯甲烷液蒸干，殘渣加三氯甲烷-甲醇（1:1）的混合溶液3ml使溶解，作為供試品溶液。另取薯蕷皂苷元對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各5～10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（20:0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性樣品無此斑點。

2.1.4 延胡索薄層色譜鑒別[3]取本品膠囊內(nèi)容物6g，加80%乙醇60ml，加熱回流 1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，加濃氨試液調(diào)至ph值9～10，用乙醚振搖提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙醇5ml使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各5～10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5:4:1)為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點清晰，在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性樣品無此斑點。

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[4]以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（31:69）為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：氮氣流速為 2 L/min；漂移管溫度為 90 ℃；增益為 1[5]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備[6]取本品膠囊內(nèi)容物20g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑1.5cm，長12cm），以水50ml洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密量取對照品溶液1、2、5、10、20μL，依次進樣，進行測定，記錄色譜峰面積，以黃芪甲苷進樣量的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），以峰面積自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），進行線性回歸，計算回歸方程為Y=2.0242X+6.9902，r=0.9997，結(jié)果表明黃芪甲苷在0.2～4μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10μl，按上述色譜條件重復(fù)測定6次，記錄峰面積，黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.08%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取2.2.3項下的供試品溶液1份于0、2、4、6、8、12、20、24h，分別精密量取10μl進樣，記錄峰面積，結(jié)果黃芪甲苷的RSD值為1.15%。表明溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取本品膠囊內(nèi)容物，平行制備6份供試品溶液分別按含量測定方法測定。結(jié)果黃芪甲苷平均含量為0.05mg/g，RSD=1.67%（n=6）。結(jié)果表明本方法重復(fù)性好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的樣品（批號：20140602，含量為0.05mg/g）10g，加入上述對照品溶液2.5ml，精密加入甲醇40ml使溶解，依法制備同一批供試品溶液 6份，測定含量，計算回收率。經(jīng)計算加樣回收率為97.67%，RSD為2.39%，表明本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可行。結(jié)果見表 1。

表1 黃芪甲苷加樣回收實驗結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl，供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得。三批樣品（批號：20140601、20140602、20140603）按干燥品計算，黃芪甲苷的平均含量為不得少于0.05mg/g。

3 討論

淫羊藿、黃芪為羊芪通絡(luò)膠囊方中的君藥，故在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過程中建立淫羊藿、黃芪的定性、定量方法，以便更好的控制該藥劑的質(zhì)量。在本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過程中，也嘗試對處方中的牛膝等藥味進行定性鑒別，但由于處方中含量較低，或檢測指標(biāo)受熱破壞等原因沒有建立定性鑒別的方法。黃芪甲苷紫外末端只有弱吸收，采用 HPLC-ELSD 測定含量，靈敏度高，結(jié)果比較理想[7]。在建立黃芪甲苷含量測定方法的過程中，本實驗首先考察乙腈-水（32:68）為流動相的分離效果，結(jié)果是黃芪甲苷峰處有一肩峰，后又通過調(diào)整流動相至乙腈-水（31:69），獲得較好的分離效果，進而確定洗脫條件。

[1]馬清娟,王晶,韓凌,呂重寧,賈凌云,路金才.HPLC法同時測定淫羊藿藥材中8種黃酮類成分的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2014,12:970-978.

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:一部[S].2010 版.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 283-284.

[3]唐秀玲,韋家福,張林麗. 仙龍抗癌膠囊薄層色譜鑒別[J].廣西醫(yī)學(xué),2002,11:1747-1748.

[4]馮琬淇,袁桂霞.HPLC-ELSD法測定阿膠三寶膏中黃芪甲苷的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2015,09:60-62.

[5]崔春利,王梅,郭東艷,唐志書.HPLC-ELSD測定芪黃顆粒中的黃芪甲苷[J].陜西中醫(yī),2013,02:236-237.

[6]劉浩文,劉嘉儀,楊妙榮,陳建萍,王冬梅.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,06:659-662.

[7]丁如賢,李霞,李一珺,孫雪妹,楊明華.黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測定方法的改進[J].世界中醫(yī)藥,2013,06:669-671.