內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷

張國中, 劉增長

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 心內(nèi)科, 重慶, 400010)

關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 心肌缺血再灌注; 應(yīng)激; 損傷

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)折疊、加工、分泌及調(diào)節(jié)Ca2+儲存、轉(zhuǎn)運的多功能細胞器。內(nèi)外環(huán)境改變可導致ER功能錯亂，使其未折疊蛋白聚集、鈣穩(wěn)態(tài)破壞，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，它本身是一種自我保護機制，但過強或過久均會導致細胞死亡，從而對心肌缺血再灌注損傷(I/R)過程中多種反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。本文就近年ERS在I/R中的研究進行綜述，現(xiàn)報告如下。

1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

缺血缺氧等各種刺激因素作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均能導致其功能紊亂，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，它參與了缺血/再灌注病理變化進程中的多步反應(yīng), 在易患I/R的小鼠心肌細胞內(nèi)可見ERS標志物的升高[1]。在初期，這種反應(yīng)通過各種效應(yīng)恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，是一種代償保護機制。

1.1　未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)通路

未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)主要是可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的分泌、對蛋白質(zhì)進行重新折疊以及對錯誤折疊蛋白的清除。其發(fā)生主要涉及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BIP)及三種ERS感受蛋白：PERk、IRE1、ATF6。在體內(nèi)外心肌缺血再灌注損傷模型中均可檢測到GRP78、PERk及IRE1表達明顯升高。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的特異性蛋白，在UPR早期還可以修復蛋白的組成。PERK是一種跨膜伴侶蛋白，被激活后可磷酸化eIF2α, 從而抑制缺血期蛋白質(zhì)的合成以及激活再灌注損傷中的細胞凋亡信號通路。eIF2α的磷酸化還可以通過促進ATF4的mRNA的轉(zhuǎn)錄從而編碼大量UPR相關(guān)目的基因，引起一系列級聯(lián)效應(yīng)。IRE1是一種有內(nèi)切核糖核酸酶的跨膜蛋白，ERS可觸發(fā)其核糖核酸酶活性，從而控制與UPR相關(guān)的包括蛋白質(zhì)折疊在內(nèi)的基因編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的生成以及磷脂的分泌；ATF6是由ERS激活的一種膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，細胞處于ERS狀態(tài)時被轉(zhuǎn)運到高爾基體后被剪切而釋放其胞質(zhì)區(qū)碎片ATF6f，從而誘導UPR目的基因的表達[2]。Yao等[3]通過實驗證明了ATF6還可以調(diào)節(jié)CHOP的表達。

1.2　其他通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度負荷反應(yīng)(EOR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的另一表現(xiàn)形式，由正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)過度蓄積激活NF-kB而引起。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是肝內(nèi)調(diào)節(jié)固醇代謝的重要蛋白，當ERS時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面合成的膽固醇被耗竭可啟動SREBP通路而調(diào)控脂代謝。實驗證明在受損的心肌細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物p-eIF2α和CHOP的上調(diào)伴隨著明顯的SREBP-1的激活[4]，并且參與I/R細胞凋亡途徑的caspase-7的表達也受SREBP的調(diào)節(jié)。

2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在I/R過程中的促細胞凋亡作用

心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)生著包括心肌細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等多種細胞在內(nèi)的凋亡，并且細胞凋亡數(shù)與心肌損傷程度呈正比。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡是不同于傳統(tǒng)的線粒體凋亡及死亡受體凋亡的另一條新的凋亡途徑，它并不直接引起細胞的凋亡，而是通過激活下游的凋亡因子，如CHOP/GADD153、ASK1/JNK、Caspases以及Bcl-2等。

2.1　激活Caspase-12通路

Caspase-12是介導ERS凋亡的關(guān)鍵分子，Caspase-12-/-的大鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可繼續(xù)發(fā)生[5], 所以Caspase-12是ERS誘導凋亡的特異性蛋白酶，與I/R中ERS介導的細胞凋亡密切相關(guān)。正常情況下caspase-12與TRAF2結(jié)合形成穩(wěn)定的復合物，不引起細胞凋亡，而ERS可激活caspase-12, 從而切割并激活caspase-9、caspase-3酶原等效應(yīng)caspases并切割多ADP聚合酶和多種其他細胞內(nèi)的底物，最終導致凋亡。阿托伐他汀可以通過降低ERS過程中caspases-12的表達，減少凋亡細胞的生成，改善再灌注后的心肌損傷、心梗面積以及左心收縮功能[6]。ERS還可以通過GHS-R1a/CaMKK/AMPK通路促進Caspase-12轉(zhuǎn)錄從而誘導凋亡[7], 磷酸化的TRAF2與IRE1結(jié)合也可以使TRAF2和caspase-12分離,激活caspase-12及細胞凋亡。

2.2　激活CHOP通路

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導細胞凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其基因啟動子中含有ATF4、ATF6、XBP1等基因的結(jié)合位點，因此ERS時誘導產(chǎn)生UPR的三條通路均可引發(fā)CHOP的表達。非ERS情況下CHOP表達很低，當ERS誘導IRE1、ATF6活化后，其胞漿部分進入核內(nèi)，啟動CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達，上調(diào)促凋亡基因Bax/Bak, 抑制抗凋亡蛋白Bcl-2, 進而誘導細胞凋亡[8]。實驗證實CHOP的抑制劑能顯著降低這種細胞凋亡過程，而其激活劑可以促進細胞凋亡。CHOP和caspase-12均促進了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生以及細胞凋亡作用的擴大，前者主要作用于再灌注損傷的早期，后者明顯地激活了接下來再灌注損傷的擴大。

2.3　激活JNK通路

JNK是MAPKs家族中的一員，主要通過IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路參與到ERS引起的I/R的細胞凋亡過程中, JNK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與缺血再灌注之間的重要的交叉通路，活化的JNK可以通過磷酸化調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白介導細胞凋亡, JNK的抑制劑SP600125可以減少缺血再灌注損傷中ERS引起的CHOP以及caspase-12的表達從而減少細胞的凋亡[5]。此外，激活的IRE1與TRAF2、ASK1結(jié)合形成IRE1/TRAF2/ASK1復合物激活JNK和p38MAPK，進而激活CHOP途徑誘導細胞凋亡[9]。

2.4　激活Bcl-2家族成員

Bcl-2家族按功能可分為兩類：促凋亡分子主要有Bax和Bak兩種，而Bcl-2/Bcl-xl能抑制細胞凋亡。當ERS激活CHOP和JNK激酶后均可削弱Bcl-2的抗凋亡作用，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Bax和Bak的構(gòu)象變化并寡聚化，最終導致膜完整性破壞、Ca2+外流，細胞質(zhì)中Ca2+濃度升高誘發(fā)細胞凋亡。在體外實驗中羌活皂甙C已被證明可以通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及改變Bcl2/Bax的比例而減弱缺氧/復氧模型中心肌細胞的凋亡[10]。

3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在I/R過程中的促炎癥作用

炎癥反應(yīng)參與了心肌缺血/再灌注損傷的全過程,其缺血損傷區(qū)有多種細胞因子表達及炎細胞浸潤。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過多種途徑促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而參與到心肌缺血再灌注損傷的進程中。

3.1　NF-κB通路

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是促炎癥反應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子，正常情況下, NF-κB與抑制因子IkB結(jié)合而呈非活性狀態(tài)，炎性刺激時NF-κB暴露其核定位信號并轉(zhuǎn)入到核內(nèi)引起炎癥相關(guān)的基因表達，產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6等炎性因子引起炎癥反應(yīng)。Wu等[11]通過實驗證實NF-κB介導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對I/R的損傷，并且其抑制劑可以減輕這種炎癥反應(yīng)。UPR的三條經(jīng)典途徑均可誘導I/R時NF-κB的激活：IKK通過受體蛋白TRAF2與IRE1形成復合物從而促使IκB磷酸化, NF-κB游離并轉(zhuǎn)位于細胞核，進而啟動炎癥基因的轉(zhuǎn)錄[12]。在IRE1-/-細胞中，ERS誘導的NF-κB的激活和炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生明顯減少，證明了IRE1能激活NF-κB。ERS激活PERK通路后, NF-κB入核增加。ERS時ATF6轉(zhuǎn)運入高爾基體，裂解成有活性的氨基末端形式，轉(zhuǎn)入核內(nèi)導致Akt的磷酸化，激活NF-κB。用ATF6 siRNA處理可抑制Akt磷酸化可以影響NF-κB表達，從而抑制炎癥反應(yīng)[13], 改善心肌缺血再灌注損傷[14]。

3.2　其他途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以通過激活AP-1通路、炎癥急性期反應(yīng)等引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生。IRE1/TRAF2/ASK1復合物及激活的JNK均可激活AP-1, 上調(diào)被AP-1轉(zhuǎn)錄因子復合物激活的炎癥因子的表達，從而促進炎癥的發(fā)生[15]。ERS時環(huán)磷腺苷cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白H從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體，被剪切后釋放其氨基端進入胞質(zhì)，與激活的ATF6形成二聚體并轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，與編碼急性期反應(yīng)蛋白的基因啟動子區(qū)域結(jié)合，參與調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)及炎癥反應(yīng)。ERS通過cAMP的表達增強了前列腺素E2、IFN-γ、IL-6的分泌，引發(fā)了機體的炎癥反應(yīng)[16]。用JNK1/2 siRNA處理后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放被完全阻斷，說明Ca2+可通過JNK途徑參與到ERS反應(yīng)中[17]。調(diào)節(jié)PI3K-AKT通路也可抑制ERS，減少炎癥因子的釋放，證實了PI3K-AKT通路也參與了ERS的促炎癥作用，并且AKT抑制劑處理后還可以降低ERS反應(yīng)及其引起的炎癥反應(yīng)[18]。

4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在I/R過程中的促自噬作用

自噬是一種高度保守并且被精密調(diào)節(jié)的細胞活動，其主要是在受損的細胞器或者聚集的蛋白質(zhì)表面會包裹雙層質(zhì)膜形成自噬體，并最終將其降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時腔內(nèi)吡啶核苷酸的代謝紊亂會導致自噬的發(fā)生[19], 并且自噬小體LC3的形成依賴于IRE-1途徑, IRE-1活化了TRAF2/JNK途徑進而調(diào)控自噬。Bcl-2也參與了自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等信號途徑的調(diào)控，被認為是多條信號通路的交叉點，因此可以利用Bcl-2抑制劑通過干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬之間的平衡而對心肌缺血再灌注起保護作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以通過PI3K-AKT-mTOR通路介導細胞的自噬[20], 當細胞缺血缺氧導致NADPH缺乏時會被激活并通過使結(jié)節(jié)硬化癥復合體2脫磷酸化引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬，同時抑制對自噬有潛在的抑制作用的mTOR。

在冠狀動脈狹窄引起心肌缺血時可見LC3、beclin-1等自噬標志物的產(chǎn)生，在離體的大鼠心肌缺血再灌注模型中也可發(fā)現(xiàn)自噬的產(chǎn)生。但關(guān)于自噬在I/R過程中起的作用還存在很多爭議，并且在缺血象和再灌注時象自噬起的作用也不同，有實驗證明在心肌缺血前用適量的衣霉素或者毒胡蘿卜素誘發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致的自噬可以減輕心肌缺血再灌注損傷的程度，減少了心梗面積及心肌細胞的凋亡，所以認為自噬在心肌細胞受損產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細胞凋亡過程中是起保護作用[21]; 但過量或過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的自噬則會導致心肌細胞的死亡。

5展望

綜上所述, ERS引起的細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自噬等參與I/R發(fā)生發(fā)展的多個階段，研究心肌缺血/再灌注損傷和ERS的關(guān)系能為心肌梗死等缺血性心肌病的研究提供重要理論基礎(chǔ)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有望阻止心肌缺血后的病理過程，因此對ERS的減弱和抑制將會成為治療心肌缺血再灌注損傷的一個新的治療靶點[22], 也將為藥物的發(fā)現(xiàn)提供新思路。早期及適當?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對機體抵抗疾病是一種代償保護機制, Sylvain Grall等證實心肌缺血進行局灶缺血后處理也可通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志物GRP78及活性AFT6而對心肌起保護作用[23], 因此將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激控制在一定程度及范圍內(nèi)將是對機體對抗疾病具有保護作用，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究的一個新的著手點，這種控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在適量的程度的手法跟預處理[24]有異曲同工之妙。

參考文獻

[1]Guo W, Jiang T, Lian C, et al. QKI deficiency promotes FoxO1 mediated nitrosative stress and endoplasmic reticulum stress contributing to increased vulnerability to ischemic injury in diabetic heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014, 75: 131.

[2]Hetz C. The unfolded protein response: controlling cell fate decisions under ER stress and beyond[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(2): 89.

[3]Yao S, Zong C, Zhang Y, et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression[J]. J Atheroscler Thromb, 2013, 20(1): 94.

[4]Zhang H M, Ye X, Su Y, et al. Coxsackievirus B3 infection activates the unfolded protein response and induces apoptosis through downregulation of p58IPK and activation of CHOP and SREBP1[J]. J Virol, 2010, 84(17): 8446.

[5]Zhu H, Zhu H, Xiao S, et al. Activation and crosstalk between the endoplasmic reticulum road and JNK pathway in ischemia-reperfusion brain injury[J]. Acta Neurochir (Wien), 2012, 154(7): 1197.

[6]Xia J G, Xu F F, Qu Y, et al. Atorvastatin Post-Conditioning Attenuates Myocardial Ischemia Reperfusion Injury via Inhibiting Endoplasmic Reticulum Stress-Related Apoptosis[J]. Shock, 2014, 42(4): 365.

[7]Zhang G G, Cai H Q, Li Y H, et al. Ghrelin protects heart against ERS-induced injury and apoptosis by activating AMP-activated protein kinase[J]. Peptides, 2013, 48: 156.

[8]Liu M X, Wang R, Wang C, et al. Panax quinquefolium saponin attenuates ventricular remodeling after acute myocardial infarction by inhibiting chop-mediated apoptosis[J]. Shock, 2013, 40(4): 339.

[9]Choi T G, Lee J, Ha J, et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is an intracellular inducer of p38 MAPK-mediated myogenic signalling in cardiac myoblasts[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(8): 1412.

[10]Wang M X, Meng B, Yu Y L, et al. Elatoside C protects against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes through the reduction of endoplasmic reticulum stress partially depending on STAT3 activation[J]. Apoptosis, 2014, 231: 567.

[11]Wu Q, Wang Q, Guo Z, et al. Nuclear factor-kappaB as a link between endoplasmic reticulum stress and inflammation during cardiomyocyte hypoxia/reoxygenation[J]. Cell Biol Int, 2014, 38(7): 881.

[12]Garg A D, Kaczmarek A, Krysko O, et al. ER stress-induced inflammation: does it aid or impede disease progression[J]. Trends Mol Med, 2012, 18(10): 589.

[13]Nakajima S, Hiramatsu N, Hayakawa K, et al. Selective abrogation of BiP/GRP78 blunts activation of NF-kappaB through the ATF6 branch of the UPR: involvement of C/EBPbeta and mTOR-dependent dephosphorylation of Akt[J]. Mol Cell Biol, 2011, 31(8): 1710.

[14]Zeng M, Yan H, Chen Y, et al. Suppression of NF-kappaB reduces myocardial no-reflow[J]. PLoS One, 2012, 7(10): e47306.

[15]Liu C M, Zheng G H, Ming Q L, et al. Protective effect of quercetin on lead-induced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in rat liver via the IRE1/JNK and PI3K/Akt pathway[J]. Free Radic Res, 2013, 47(3): 192.

[16]Hosoi T, Honda M, Oba T, et al. ER stress upregulated PGE(2)/IFNgamma-induced IL-6 expression and down-regulated iNOS expression in glial cells[J]. Sci Rep, 2013, 3: 3388.

[17]Verma G, Bhatia H, Datta M, JNK1/2 regulates ER-mitochondrial Ca2+ cross-talk during IL-1beta-mediated cell death in RINm5F and human primary beta-cells[J]. Mol Biol Cell, 2013, 24(12): 2058.

[18]Zhou S, Yin X, Zheng Y, et al. Metallothionein prevents intermittent hypoxia-induced cardiac endoplasmic reticulum stress and cell death likely via activation of Akt signaling pathway in mice[J]. Toxicol Lett, 2014, 227(2): 113.

[19]Kapuy O, Banhegyi G. Depletion of luminal pyridine nucleotides in the endoplasmic reticulum activates autophagy with the involvement of mTOR pathway[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013: 942431.

[20]Kim H S, Kim T J, Yoo Y M. Melatonin combined with endoplasmic reticulum stress induces cell death via the PI3K/Akt/mTOR pathway in B16F10 melanoma cells[J]. PLoS One, 2014, 9(3): e92627.

[21]Park M, Sabetski A, Chan Y K, et al. Palmitate induces ER stress and autophagy in H9c2 cells: implications for apoptosis and adiponectin resistance[J]. J Cell Physiol, 2014, 45: 231.

[22]Muralidharan S, Mandrekar P. Cellular stress response and innate immune signaling: integrating pathways in host defense and inflammation[J]. J Leukoc Biol, 2013, 94(6): 1167.

[23]Grall S, Prunier-Mirebeau D, Tamareille S, et al. Endoplasmic reticulum stress pathway involvement in local and remote myocardial ischemic conditioning[J]. Shock, 2013, 39(5): 433.

[24]Wang X B, Huang X M, Ochs T, et al. Effect of sulfur dioxide preconditioning on rat myocardial ischemia/reperfusion injury by inducing endoplasmic reticulum stress[J]. Basic Res Cardiol, 2011, 106(5): 865.

通信作者:劉增長

收稿日期:2014-12-20

中圖分類號:R 542.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-170-03DOI: 10.7619/jcmp.201507058