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        整合素αvβ3拮抗劑SB—273005對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

        2015-04-02 22:43:48尚發(fā)軍艾文兵熊志云馮定坤彭智
        中外醫(yī)療 2014年34期

        尚發(fā)軍++++++艾文兵++++++熊志云++++++馮定坤++++++彭智

        [摘要] 目的 檢測(cè)整合素αvβ3拮抗劑SB-273005對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)量及其磷酸化的影響。方法將C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,分對(duì)照組(0 mg/L)、SB-273005低濃度組(25 mg/L)和SB-273005高濃度組(50 mg/L)3組,采用western法檢測(cè)不同濃度的SB-273005對(duì)C6細(xì)胞踝蛋白(talin)、生存素蛋白(survivin)表達(dá)量以及其磷酸化的變化,并檢測(cè)各組蛋白條帶光密度變化。 結(jié)果 不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞talin、survivin蛋白的表達(dá),對(duì)二者的磷酸化有明顯的抑制作用。測(cè)得對(duì)照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組蛋白條帶光密度,得出talin/β-actin比值分別為0.76、0.43、0.26(*P<0.05);磷酸化的talin/β-actin比值分別為0.82、0.33、0.15(*P<0.05)。survivin/β-actin比值分別為0.84、0.21、0.09.(*P<0.05),磷酸化的survivin/β-actin比值分別為0.19、0.04、0.01(*P<0.05)。3組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 SB-273005對(duì)大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞talin、survivin蛋白表達(dá)量及其磷酸化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

        [關(guān)鍵詞] C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞;踝蛋白;生存素; SB-273005

        [中圖分類(lèi)號(hào)] R3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742(2014)12(a)-0044-02

        目前研究發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,talin、survivin所能發(fā)揮的生物學(xué)作用與整合素αvβ3的活性狀態(tài)密切相關(guān)[1]。talin與survivin蛋白的磷酸化水平與膠質(zhì)瘤惡性程度存在關(guān)聯(lián)性,膠質(zhì)瘤的惡性程度越高,二者的磷酸化水平隨之增高[2]。因此,該實(shí)驗(yàn)2013年12月—2014年6月間通過(guò)采用整合素αvβ3拮抗劑SB-273005,抑制整合素活性,觀察整合素αvβ3的活性改變后與talin、survivin的表達(dá)量及其磷酸化是否存在相關(guān)性,并探討其作用機(jī)制,以期為腦膠質(zhì)瘤的治療尋求更有效的方法,報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        實(shí)驗(yàn)自2013年12月開(kāi)始,2014年6月結(jié)束。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室提供;整合素αvβ3拮抗劑SB-273005為Dupont公司產(chǎn)品;抗talin抗體、survivin抗體、survivin磷酸化單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物公司; DMEM培養(yǎng)基、FBS、RIPA緩沖液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等試劑由廣州賽哲生物科技有限公司提供。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞樣品制備 大鼠C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),待其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)濃度為1×104~1×105/mL,并分為對(duì)照組(0 mg/L)、nm23-H2低濃度組(25 mg/L)和nm23-H2高濃度組(50 mg/L)3組,20 h后收集細(xì)胞樣品,加入RIPA裂解緩沖液收集裂解物,取上清備用。

        1.2.2 Western Blotting 樣品行SDS-PAGE, 電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上,牛奶封閉液封閉2~4 h,依次加入一抗(抗talin、survivin及對(duì)應(yīng)磷酸化抗體1∶1 000稀釋?zhuān)覝? h后,加羊抗兔二抗(1∶400 0),2 h后顯影。Image J軟件分析檢測(cè)各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)方法

        采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,用 t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細(xì)胞talin表達(dá)量及磷酸化

        加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制talin表達(dá)量及磷酸化,且隨著SB-273005濃度升高,其對(duì)talin表達(dá)及磷酸化的抑制呈增高趨勢(shì),見(jiàn)圖1,2,3。

        2.2 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細(xì)胞survivin表達(dá)量及磷酸化

        加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制survivin表達(dá)量及磷酸化,并且隨著SB-273005濃度升高,其對(duì)survivin表達(dá)及磷酸化的抑制呈增高趨勢(shì)。見(jiàn)圖4,5,6。

        2.3 Image J軟件分析檢測(cè)各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)

        Image J軟件分析檢測(cè)各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù),以數(shù)據(jù)表顯示。隨SB-273005處理濃度的增加,talin、survivin蛋白的表達(dá)量及磷酸化水平明顯下降,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05);與SB-273005低濃度組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(△P<0.05),見(jiàn)表1。

        表1 各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)

        3 討論

        目前研究證實(shí),整合素αvβ3參與多條信號(hào)通路的調(diào)控,通過(guò)與ECM配體結(jié)合,促成黏著斑復(fù)合物的形成[3]。同時(shí),該復(fù)合物所包含的配體以及其他信號(hào)分子暴露其活化位點(diǎn),通過(guò)與下游的染色質(zhì)片段或蛋白相互作用[4],產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

        該研究結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組通過(guò)加入不同濃度的αvβ3拮抗劑SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞talin蛋白的表達(dá),對(duì)其磷酸化有明顯的抑制作用。測(cè)得對(duì)照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分別為0.82、0.33、0.15(*P<0.05)。3組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者同樣證實(shí),talin蛋白的磷酸化主要通過(guò)C-端區(qū)上的序列發(fā)揮作用,且多在細(xì)胞粘附之前,就已完成多個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化。其中,最重要的自主磷酸化部位Tyr397在這一過(guò)程中起至關(guān)重要的作用[5]。這與實(shí)驗(yàn)中,磷酸化的talin的檢測(cè)結(jié)果相符。并提示talin有可能是整合素黏著斑形成初期所依賴(lài)的基礎(chǔ)分子,多個(gè)磷酸化位點(diǎn)為后期整合素相關(guān)信號(hào)通路激活發(fā)揮重要作用[6]。endprint

        目前認(rèn)為,整合素激活talin的可能模式是:整合素αvβ3受到信號(hào)刺激后,整合素-talin相互作用,使多個(gè)talin分子相互磷酸化而被激活。并通過(guò)對(duì)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活,對(duì)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路予以調(diào)控,從而發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。

        與talin蛋白不同,Survivin蛋白在多個(gè)腫瘤細(xì)胞中,與P53、bcl 2蛋白存在相關(guān)性。該研究結(jié)果顯示:加入各實(shí)驗(yàn)組不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá),對(duì)二者的磷酸化有明顯的抑制作用。3組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)內(nèi)已經(jīng)有研究證實(shí),Survivin蛋白可以通過(guò)結(jié)合caspase家族蛋白形成的DISC和細(xì)胞色素C分別激活內(nèi)源性與外源性?xún)蓷l通路調(diào)控細(xì)胞的凋亡[7]。Survivin可以通過(guò)調(diào)控caspase-3 的活性導(dǎo)致核糖體的磷酸化,而后者可以使細(xì)胞進(jìn)入周期,減少凋亡[8]。雖然三者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性生長(zhǎng)等惡性生物學(xué)方面均起重要調(diào)節(jié)作用。但其具體的作用機(jī)制并不清楚。在腫瘤微環(huán)境的條件下,哪一種機(jī)制是起主導(dǎo)作用的,還有待進(jìn)一步研究。

        綜上,該研究表明整合素αvβ3拮抗劑SB-273005能有效地抑制talin、survivin表達(dá)量及其磷酸化程度,且均呈劑量依賴(lài)性抑制作用,為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)研究提供依據(jù),為后期中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供新的方法。

        [參考文獻(xiàn)]

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        (收稿日期:2014-08-27)endprint

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