溫龑++裴峻浩翔++段開(kāi)文

摘要：目的 了解云南地區(qū)部分HIV感染患者口腔內(nèi)牙周致病菌檢出情況。方法 采用臨床標(biāo)本收集的方法，獲得昆明市第三人民醫(yī)院感染一科66例HIV感染者的唾液標(biāo)本和齦溝液標(biāo)本，通過(guò)DNA的提取和PCR檢測(cè)，對(duì)標(biāo)本中的6種牙周致病菌進(jìn)行檢測(cè)并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析。結(jié)果 不同細(xì)菌在不同取材標(biāo)本都有檢出，且各種細(xì)菌的檢出率差異很大，但同一細(xì)菌在不同樣本中檢出率差異卻極小。另外，吸煙飲酒、不同CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active anti retrovial therapy，HAART）HAART對(duì)可疑牙周致病菌的檢出均無(wú)明顯影響。結(jié)論 應(yīng)結(jié)合國(guó)內(nèi)外的研究與報(bào)道，加強(qiáng)對(duì)HIV感染者口腔牙周致病菌的研究與檢測(cè)，從而有針對(duì)性的治療發(fā)生在HIV感染者口腔中的牙周疾病。

關(guān)鍵詞：人類(lèi)免疫缺陷病毒；牙周致病菌；齦溝液；唾液

Analysis for Detection of Oral Periodontal Pathogens in HIV Infected Patients

WEN Yan1，PEIJUN Hao-xiang1，DUAN Kai-wen2

（1.Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan，China；

2.Department of Stomatology，Yanan Hospital of Kunming City，Kunming 650051，Yunnan，China）

Abstract：Objective To understand the detection of oral periodontal pathogens in part of HIV infected patients in Yunnan region.Methods The collection of clinic specimens were took to obtain the 66 cases of HIV infected patients，saliva and gingival crevicular fluid（GCF）samples which were come from the Third People，s of Kunming.The six kinds of periodontal pathogens were detected by extraction of DNA and PCR testing and analyzed by using statistical methods.Results The different bacteria have been detected in different specimens and the discrepancy of detection rate of these bacteria was significant.However，the difference of same bacterial in different samples was minimal.In addition，there was no manifest function on the detection rate of periodontal pathogens in aspects of smoking，drinking，different CD4 cell counts and highly active antiretroviral therapy（HAART）.Conclusion It is vital to strengthen the research and detection of oral periodontal pathogens in HIV infected patients through combine with domestic and international research and report to treat targeted periodontal disease that occurred in HIV infected patients.

Key words：Human immunodeficiency virus；Periodontal pathogens；Gingival crevicular fluid；Saliva

牙周疾病的發(fā)生一般被認(rèn)為取決于宿主和存在的口腔定植微生物群之間的相互作用[1]。在HIV感染者齦溝液中頻繁檢測(cè)出較普遍存在的機(jī)會(huì)性微生物群，可能因?yàn)槊庖咭种茣?huì)促進(jìn)非典型致病菌定居并增生，所以認(rèn)識(shí)HIV感染者齦下區(qū)域不同的微生物特征很重要。研究表明HIV感染者牙周病變部位較于健康牙周組織微生物特點(diǎn)更復(fù)雜[2]，同時(shí)某些微生物的組合僅僅在HIV感染者中發(fā)現(xiàn)。本項(xiàng)研究的目的是應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)6種常見(jiàn)的牙周可疑致病菌在HIV陽(yáng)性患者口腔中的存在情況，并分析影響因素。

1資料與方法

1.1一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：2011年8月～9月前往昆明市第三人民醫(yī)院感染一科就診的HIV感染者共66例，其中未使用HAART 34例（A組），使用HAART 32例（B組）。健康對(duì)照組：2011年8月～9月前往昆明市延安醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群32例（O組），HIV陰性，年齡性別等基本與患者組匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)：①3w內(nèi)接受過(guò)口腔治療；②患者自己不愿意配合。

1.2口腔樣本的收集

1.2.1唾液標(biāo)本 采集唾液前禁食1h并用蒸餾水漱口；采集時(shí)使用無(wú)菌脫脂棉從患者舌下、頰粘膜腮腺導(dǎo)管開(kāi)口附近吸取唾液，將所獲樣本置于盛有1ml滅菌的硫乙醇酸鹽溶液的EP管中，-70°C中保存。

1.2.2齦溝液標(biāo)本 所選牙位為16、11、26、31、36、46，，所有受試者采樣前均用1%H2O2溶液漱口，消毒棉球拭干，隔濕，將滅菌紙尖輕輕插入牙周袋或齦溝底30s，取樣后的紙尖置于200？滋l TE緩沖液，-70℃凍存待用。

1.3兩種標(biāo)本DNA的抽提和純度檢測(cè) 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP302）進(jìn)行唾液及齦溝液DNA的提?。ň唧w步驟按生產(chǎn)廠家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作）。獲得的DNA使用核酸定量?jī)x檢測(cè)純度OD260/OD280比值，比值介于1.7～2.0，表示DNA純度良好，能滿足PCR檢測(cè)要求。按下列公式計(jì)算濃度：

DNA濃度（μg/ml）=OD260×50×稀釋倍數(shù)。

1.4口腔可疑牙周致病菌的PCR檢測(cè) 第一步PCR反應(yīng)：根據(jù)Siqueira等[3]報(bào)道的方法，設(shè)計(jì)16SrRNA細(xì)菌通用引物序列（見(jiàn)表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

第二步PCR反應(yīng)：根據(jù)Siqueira等[3]報(bào)道的方法分別設(shè)計(jì)針對(duì)牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis），中間普氏菌（P.intermedia），齒垢密螺旋體（T.denticola），福塞尼桿菌（T.forsythensis），中間普氏菌（F.nucleatum），伴放線放線桿菌（A.actinomycetemcomitans）的特異引物（見(jiàn)表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照為昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院張明珠博士保存的6種國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)菌株，陰性對(duì)照為去離子水，其目的是檢測(cè)通用引物的通用性和特異引物的特異性。

1.5細(xì)菌檢出判定 取6ul擴(kuò)增產(chǎn)物，使用含0.5ug/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。臨床樣本中，若陽(yáng)性對(duì)照獲得相應(yīng)條帶而陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶的情況，則記錄該樣本中此種微生物檢出為陽(yáng)性，否則為陰性。每種細(xì)菌每份標(biāo)本做兩次，若出現(xiàn)結(jié)果不一致，則重復(fù)進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)各組病原菌數(shù)量檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并比較其檢出率與吸煙、飲酒、CD4計(jì)數(shù)等因素的關(guān)系；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同取材口腔標(biāo)本6種可疑牙周致病菌檢出情況 采用巢式PCR技術(shù)對(duì)來(lái)自唾液和齦溝液標(biāo)本進(jìn)行6種細(xì)菌的檢測(cè)表明，在不同類(lèi)型標(biāo)本均可檢測(cè)不同的細(xì)菌。見(jiàn)圖1～圖7。下圖顯示了本研究所設(shè)計(jì)的通用引物和6種細(xì)菌特異引物從齦溝液提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行的巢式PCR檢測(cè)情況。

圖1部分齦溝液提取DNA的細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)電泳圖。

從右到左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 部分齦溝液提取DNA牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）PCR檢測(cè)電泳圖

從右向左依次：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3 部分齦溝液樣本提取DNA中間普氏菌（P.intermedia）檢測(cè)電泳圖

從右向左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖4 部分齦溝液樣本提取DNA齒垢密螺旋體（T.denticola）檢測(cè)電泳圖

從右向左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖5 部分齦溝液樣本提取DNA福塞尼桿菌（T.forsythensis）檢測(cè)電泳圖

從右向左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖6 部分齦溝液樣本DNA具核梭桿菌（F.nucleatum）檢測(cè)電泳圖

從右向左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖7 部分齦溝液樣本DNA伴放線放線桿菌（A.actinomycetemcomitans）檢測(cè)電泳圖

從右向左依次為：DNA Marker（DL100），陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，和8份樣本提取DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 6種可疑牙周致病菌在三組人群不同口腔標(biāo)本的檢出情況 對(duì)所有收集的唾液和齦溝液進(jìn)行了6種細(xì)菌（P.gingivalis，P.intermedia，T.denticola，T.forsythensis，F(xiàn).nucleatum，A.actinomycetemcomitans）的檢測(cè)情況，見(jiàn)表2。從表中可以看出盡管不同細(xì)菌在不同取材標(biāo)本都有檢出，但各種細(xì)菌的檢出率差異很大，檢出率最高的是T.forsythensis（約98%），最低為A.actinomycetemcomitans（僅3.06%）。但同一細(xì)菌在不同樣本中檢出率差異極小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 6種細(xì)菌檢出情況與其他一些因素之間的關(guān)系

2.3.1與吸煙飲酒之間的關(guān)系 三組人群按吸煙和飲酒程度進(jìn)行了分級(jí)，分析吸煙和飲酒對(duì)6種細(xì)菌分布是否有影響，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，P.intermedia的檢出率在輕、中、重度吸煙人群的樣本檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），其余5種細(xì)菌與抽煙程度無(wú)明顯關(guān)系。而飲酒對(duì)6種細(xì)菌的檢出率影響不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。

2.3.2不同CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)與6種可疑牙周致病菌檢出率之間的關(guān)系 將AB兩組HIV感染者按CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)水平分為≥500、201～499和≤200，分析6種細(xì)菌的檢出率與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)之間關(guān)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3.3 HAART對(duì)6種可疑牙周致病菌檢出的影響 本研究人群中有32例正在接受HAART治療，將藥物使用時(shí)間分為1～3月、3～6月和6月以上，分析了使用HAART時(shí)間長(zhǎng)短與6種細(xì)菌檢出的關(guān)系，三個(gè)時(shí)間段患者細(xì)菌檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3討論

3.1 6種可疑牙周致病菌的檢出情況 本研究采用細(xì)菌16sRNA為基礎(chǔ)的PCR法，檢測(cè)并比較了牙齦卟啉單胞菌（Pg）、中間普氏菌（Pi）、齒垢密螺旋體（Td）、福塞尼桿菌（Tf）、中間普氏菌（Fn）和伴放線放線桿菌（Aa）在HIV感染者和對(duì)照人群唾液和齦溝液中的檢出情況，發(fā)現(xiàn)除伴放線放線桿菌僅在HIV陰性對(duì)照組中檢出外，其它5種細(xì)菌在所有被檢人群中均不同比例檢出，且在不同部位所取樣本的檢驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

關(guān)于可疑牙周致病菌在不同來(lái)源口腔標(biāo)本的檢出情況，國(guó)內(nèi)外學(xué)者有諸多報(bào)道，但所得結(jié)論存在差別。Testa等[5]認(rèn)為唾液和齦溝液樣本在牙周致病菌的檢出率中沒(méi)有顯著差異，但馮向輝等[6]發(fā)現(xiàn)唾液樣本在伴放線放線桿菌的檢測(cè)上精確性更高。

3.2 HIV感染者中6種牙周致病菌檢查情況分析 在本組HIV感染者口腔標(biāo)本中除伴放線放線桿菌外的5種細(xì)菌檢出率與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Patel等[7]通過(guò)對(duì)20例HIV+/牙周炎患者的中間普氏菌和牙齦卟啉單胞菌等七種可疑牙周致病菌檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，齒垢密螺旋體和牙齦卟啉單胞菌在HIV感染中較少發(fā)現(xiàn)。Gon？觭alves等[8]通過(guò)棋盤(pán)DNA雜交檢測(cè)，在HIV+/牙周炎患者中發(fā)現(xiàn)一些典型的牙周致病菌檢出率高于HIV+/牙周健康患者，且在兩組中糞腸球菌（E.faecalis）檢出率較高。各地報(bào)道差異很大，可能與研究人群、生活環(huán)境、全身健康等不同有關(guān)。

3.3 6種細(xì)菌檢出情況與其他一些因素之間的關(guān)系 本研究發(fā)現(xiàn)中間普氏菌的檢出率在不同程度的吸煙人群之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，重度吸煙人群中其檢出率明顯下降，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)飲酒與細(xì)菌檢出率存在關(guān)系。

有研究顯示，免疫抑制較嚴(yán)重的患者（CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于200個(gè)/ml），糞腸球菌，具核梭桿菌的檢出率明顯增高，提示免疫抑制有利于一些細(xì)菌的定殖和過(guò)度繁殖。在本項(xiàng)研究中，在HIV感染者中6種細(xì)菌的檢出率與不同的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

國(guó)外有報(bào)道認(rèn)為相比較于HIV陰性患有慢性牙周炎的人群，可疑牙周致病菌檢出率更高，而一些非可疑牙周致病菌更常在接受HAART的HIV陽(yáng)性人群中出現(xiàn)[9]，提示對(duì)于接受HAART的HIV感染者，牙周致病菌的種屬有所變化。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)接受HAART對(duì)6種觀測(cè)細(xì)菌檢出有影響，是否與觀察時(shí)間短有關(guān)仍待探明。

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編輯/王敏