蔡壬辛 ，洪旭燦 ，張軒 ，李沫 ，秦笙 ，許振杰 ，曾建明

(1、廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510006；2、佛山市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 佛山528000)

CD44是廣泛分布于多種細(xì)胞表面的糖蛋白分子，屬黏附分子的成員，具有多種重要的生物功能，它與細(xì)胞黏附、淋巴細(xì)胞活化和歸巢、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1,2]；CD44分子呈廣泛多態(tài)性，多態(tài)性主要由核心肽的不同及翻譯后的糖基化修飾引起[3]。目前對CD44分子的研究主要集中在實(shí)體瘤，相繼發(fā)現(xiàn)CD44v6亞型的過度表達(dá)與多種人體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子[4-7]。

化療后復(fù)發(fā)是白血病治療的難點(diǎn)，近十年提出殘留的白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSCs)是疾病復(fù)發(fā)的根源。有研究提示拮抗LSCs黏附、歸巢(homing)途徑可能有助于殺滅LSCs[8]。有研究發(fā)現(xiàn)CD44單克隆抗體A3D8通過抑制ERK1/2上調(diào)Bim誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞早期凋亡[9]。CD44通過p27Kip1途徑抑制AML細(xì)胞增殖[10]。伊馬替尼是治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的一線藥物，它能夠降低JURL-MK1細(xì)胞CD44等分子表達(dá)，并引起細(xì)胞凋亡[11]；現(xiàn)發(fā)現(xiàn)伊馬替尼耐藥細(xì)胞中CD44亦表達(dá)增高[12]，阻斷CD44有益于CML患者自體移植[13,14]。另外，CD44在AML和CML的LSCs細(xì)胞龕中發(fā)揮重要作用[15]。此外，淋巴瘤CD44高表達(dá)患者發(fā)生治療不緩解或復(fù)發(fā)，甚至死亡率更高[16]；小鼠動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)BCR-ABL1轉(zhuǎn)染的CD44缺陷干細(xì)胞不能在受體小鼠骨髓歸巢[13]，這提示通過干預(yù)CD44途徑實(shí)現(xiàn)拮抗殘留的LSCs，有望成為白血病治療新的切入點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過PCR檢測臨床血液腫瘤患者和細(xì)胞株CD44分子，并通過基因重組技術(shù)構(gòu)建CD44胞外區(qū)(hCD44om)多肽原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá)，為下一步研究CD44骨髓靶向功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 主要試劑 X-gal、IPTG、 氨芐西林鈉(Amp)、低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，購自大連寶生物工程有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、低熔點(diǎn)瓊脂糖，購自北京原平皓生物工程公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、HindⅢ，連接酶，Ex TaqDNA聚合酶為 TakaRa公司產(chǎn)品；Trizol、DNA Marker、質(zhì)粒抽提和膠回收試劑盒為東盛公司產(chǎn)品，蛋白Marker、異丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)為Fermentas公司產(chǎn)品；ECL超敏發(fā)光液為北京普利萊公司產(chǎn)品，兔抗人CD44單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，羊抗兔IgG-HRP為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.1 .2標(biāo)本 血標(biāo)本源于廣東省中醫(yī)院臨床樣本。9個標(biāo)本中，4例為急性白血病(AML)，5例為慢性粒細(xì)胞白細(xì)胞 (CML)；K562、HL-60細(xì)胞源于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室。

1.1 .3 菌種和質(zhì)粒 質(zhì)粒pET32a(+)、大腸埃希菌(E.coli)DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，BL21(DE3)由東盛生物公司提供。

1.1 .4 PCR引物 根據(jù)Genbank基因序列設(shè)計引物，由北京華大基因技術(shù)有限公司合成。P1：5’-CCGGAATTCATGGACAAGTTTTGGTGGCACG-3’(含 EcoR I 酶切位點(diǎn))；P2：5’-CGCAAGCTTTTCTGGAATTTGGGGTGTCCT-3’(含 HindⅢ 酶切位點(diǎn))。

1.2 方法

1.2 .1 cDNA的制備 采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，Trizol提取總RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩⒄誌nvitrogen公司試劑盒（貨號1559026）說明書提取細(xì)胞總RNA，按TakaRa試劑盒說明書進(jìn)行 RT-PCR。 PCR 條件：95℃預(yù)變性 5 min；94℃45s、55℃ 40s、72℃延伸 1min，共 30 個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2 .2重組質(zhì)粒pET32-CD44的構(gòu)建 凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)EcoR I、HindⅢ雙酶切后與同樣雙酶切的 pET32a(+)質(zhì)粒 16℃連接3h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于60μg/ml Amp LB平板，培養(yǎng)10～14h后挑選單個菌落，轉(zhuǎn)移至3ml 60μg/m l Amp LB培養(yǎng)，37℃ 250r/min搖菌培養(yǎng)10~14h，菌液煮沸后PCR鑒定；同時送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2 .3 CD44胞外區(qū)的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序鑒定正確的重組表達(dá)載體pET32-CD44轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個克隆于含60μg/m l Amp LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。取60μl過夜培養(yǎng)液菌至3ml 60μg/ml Amp LB，培養(yǎng)至A600值為0.6~0.8時，加入終濃度為 0.2、0.4、0.6和 1.0 mM 的 IPTG，37℃振蕩培養(yǎng) 4h，4℃離心收集菌體，10%SDSPAGE分析；然后以終濃度為1.0 mM的IPTG在37℃誘導(dǎo)2h~5h，再進(jìn)行SDS-PAGE分析；同時進(jìn)行30℃誘導(dǎo)表達(dá)。以BandScan5.0軟件分析蛋白表達(dá)情況。按優(yōu)化后條件擴(kuò)大培養(yǎng)，分別取上清及包涵體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。以pET28a(+)-GFP為陽性對照，BL21(DE3)菌為陰性對照。

1.2 .4 Western blot細(xì)菌裂解產(chǎn)物離心后經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h后，與兔抗人CD44單克隆抗體(1:5000)37℃孵育 2h；1×TBS-T(1×TBS，0.05 Tween 20)充分洗滌，然后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:3000)37℃孵育2h；洗膜后用加入ECL發(fā)光液浸泡2min，暗室顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1 CD44基因檢測 除K562細(xì)胞組擴(kuò)增結(jié)果為陰性外，9例臨床標(biāo)本和HL-60細(xì)胞的PCR產(chǎn)物電泳均獲得特異性電泳條帶(結(jié)果未展示)。PCR結(jié)果測序后經(jīng)DNAman軟件比對分析，發(fā)現(xiàn)HL-60 CD44與9例臨床標(biāo)本序列差異較大，其與參考序列比對發(fā)現(xiàn)其匹配度為 83.83%(見圖1)；再以BLASTX程序比對nr蛋白庫，發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞與CD44isoform4型一致性最高，但第21位出現(xiàn)4個氨基酸HPHQ(H:組氨酸,P:脯氨酸,Q:谷氨酰胺)，160~213氨基酸出現(xiàn)較高頻率的點(diǎn)突變；其余標(biāo)本為CD44isoform4型(NP_001001391.1)。比對結(jié)果見圖2。

圖1 HL-60細(xì)胞CD44測序部分結(jié)果

圖2 HL-60細(xì)胞CD44測序結(jié)果的BLASTX比對分析

2.2 pET32-CD44鑒定結(jié)果 PCR鑒定pET32-CD44轉(zhuǎn)化子，1%瓊脂糖凝膠電泳見DNA條帶位置與預(yù)計的產(chǎn)物804bp一致 (圖3)；測序結(jié)果與Genbank序列比對完全一致，部分峰型圖結(jié)果見圖4。

圖3 pET32-CD44質(zhì)粒鑒定圖

圖4 pET32-CD44質(zhì)粒部分測序結(jié)果

2.3 CD44胞外區(qū)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 pET32-CD44轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。CD44的優(yōu)化表達(dá)結(jié)果，各溫度、各時間點(diǎn)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳(圖5)。與不含質(zhì)粒BL21(DE3)相比在53KD處出現(xiàn)一條蛋白表達(dá)條帶，片段大小與預(yù)期值相符。用BandScan5.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)量影響不大 (圖5A)，1 mM IPTG，37℃誘導(dǎo)2h的表達(dá)量最大，占總蛋白的48.6%。

2.4 CD44的表達(dá)形式分析 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的10%SDS-PAGE結(jié)果見圖6。BandScan5.0分析hCD44om在2h細(xì)菌裂解液的沉淀中占總蛋白的37.3%，在上清中占總蛋白的14.2%；在3h細(xì)菌裂解液的沉淀中占總蛋白的23.8%，在上清中占總蛋白的21.8%，表明該蛋白在菌體中同時有包涵體和可溶表達(dá)兩種形式，隨著誘導(dǎo)時間不同，蛋白存在形式發(fā)生改變。

圖5 蛋白表達(dá)產(chǎn)物10%SDS-PAGE結(jié)果

圖6 SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式

2.5 Western blot鑒定 1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)2h細(xì)菌裂解沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜后以兔抗人CD44單克隆抗體(1:5000)為一抗，進(jìn)行ECL顯影(圖7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在53KD處出現(xiàn)特異性條帶，且顯色條帶隨蛋白加入量增加而增強(qiáng)。

圖7 Western blot分析人CD44蛋白特異性

3 討論

近年來在研究CD44基因及蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)上，對其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的機(jī)制進(jìn)行了大量探索[17]，對腫瘤干細(xì)胞的表型研究亦發(fā)現(xiàn)CD44為多種腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物，因此針對CD44的靶向治療可能揭示分子靶點(diǎn)治療的新前景。

CD44基因含20個外顯子(exon)，其中exon1~5，exon16~20為組成型表達(dá)，中間的exon6~15則為可變表達(dá)，因此命名為v1~v10[18]。CD44v轉(zhuǎn)錄方式十分復(fù)雜，其中，CD44v6亞型高表達(dá)與實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲密切相關(guān)；而CD44v在血液腫瘤中的研究尚不夠清楚。

本實(shí)驗(yàn)基于CD44基因剪切模式研究進(jìn)展，設(shè)計上游引物位于exon1上，下游引物跨exon16、exon17a，因此，理論上可以檢測到不同的CD44v亞型。測序結(jié)果顯示AML、CML臨床標(biāo)本均為CD44isoform4 型 (圖 1)，HL-60 為 CD44isoform4 變異性，且有多個氨基酸發(fā)生突變。估計與細(xì)胞株基因組不穩(wěn)定有關(guān)。此外，未能在K562細(xì)胞株中檢出CD44(重復(fù)3次)，與文獻(xiàn)報道不一致，原因不明[14,19,20]。

在蛋白表達(dá)方面，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pET32a/BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)不能夠表達(dá)CD44全長蛋白(其編碼區(qū)CDS插入到pET32a(+)的EcoR I和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間，數(shù)據(jù)未顯示)，而重新設(shè)計引物克隆無信號肽的CD44胞外區(qū)則可以被IPTG高效誘導(dǎo)表達(dá)。在課題組前期進(jìn)行的CD96蛋白的表達(dá)中也觀察到類似的情況[21]，估計這與CD44信號肽和跨膜區(qū)氨基酸極性有關(guān)。本文對蛋白原核表達(dá)所用IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對CD44表達(dá)量影響不大，37℃結(jié)果略高于30℃，2~3h時達(dá)到較高的表達(dá)水平，這與CD96蛋白誘導(dǎo)條件不同[21]。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD44在細(xì)菌裂解液沉淀和上清中含量在不斷變化，表明該蛋白以包涵體和可溶性形式表達(dá)，同時隨著誘導(dǎo)時間延長，蛋白存在的形式也發(fā)生改變。此外，Western blot分析發(fā)現(xiàn)：CD44單克隆抗體在53KD處有條帶，在53KD條帶下還有小的拖尾帶，可能是目的蛋白降解所致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AML和CML患者外周血細(xì)胞表達(dá)CD44isoform4型分子，HL-60細(xì)胞為CD44isoform4變異性，K562細(xì)胞中不表達(dá)CD44，為后續(xù)研究CD44在髓系白血病中的作用奠定基礎(chǔ)；同時，實(shí)驗(yàn)獲得CD44isoform4胞外區(qū)片段，為進(jìn)一步研究單克隆抗體制備提供了基礎(chǔ)。

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