孫曉璐，張新紅，王明躍，張 源

(阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236031)

皖北地區(qū)，實(shí)屬中原腹地，物產(chǎn)富足，適合于白酒的生產(chǎn)與釀造，以沿淮河釀酒帶涌現(xiàn)出以“淡雅型”風(fēng)格為主體的釀造白酒，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，獨(dú)樹(shù)一幟。目前，以古井貢、口子窖、金種子，迎駕、高爐家等多家生產(chǎn)白酒的優(yōu)秀企業(yè)為代表，成為皖酒系列的一張名片。

在釀造白酒過(guò)程中所需的大曲是白酒生產(chǎn)的骨架，而大曲的生產(chǎn)是靠傳統(tǒng)工藝自然接種，網(wǎng)羅自然界中的各種微生物在上面生長(zhǎng)而制成的，是大曲酒生產(chǎn)中的糖化發(fā)酵劑，因此大曲中的微生物類(lèi)群及為豐富，是多種微生物的混合體系，主要包括霉菌、細(xì)菌和酵母菌，在這樣一個(gè)龐大而復(fù)雜的微生物環(huán)境下，通過(guò)糖化、發(fā)酵、生香的綜合作用讓我們的白酒具有甘洌爽口，回味悠長(zhǎng)，充分體現(xiàn)了大曲酒的酒體特征[1]。

而大曲中的酵母菌則是近年來(lái)釀酒工作者研究的熱點(diǎn)，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，主要有酒精酵母、假絲酵母、產(chǎn)酯酵母等多種酵母菌，在發(fā)酵、代謝過(guò)程中對(duì)白酒的風(fēng)格形成起到重要作用[2]。因此分離、鑒定大曲中的酵母菌，可以為研究酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中生物特性的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

皖北地區(qū)某酒廠提供的中溫的大曲。

1.1.2 試劑

孟加拉紅、青霉素鈉、TTC、95%乙醇、苯酚紅、美藍(lán)、氯化鈉、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、Tris。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-328 型生化培養(yǎng)箱、DHG-9070 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子分析天平、ZHJH-C1112C 超凈工作臺(tái)、微波爐、熒光倒置顯微鏡、冷藏箱、微量移液器。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初篩實(shí)驗(yàn)

通過(guò)富集培養(yǎng)，涂布平板，從長(zhǎng)勢(shì)較好的培養(yǎng)基中挑取表面光滑、濕潤(rùn)、菌落顏色為乳白色的單菌落挑出一環(huán)，放入9 mL 的無(wú)菌水試管中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)渲瞥?0－1的菌懸液，以此類(lèi)推，配制成10－2，10－3，10－4……菌懸液?；靹蚝?，分別從上述試管中吸取1mL 涂布于YPD 培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣，28 ℃下培養(yǎng)24 h[3]。

1.2.2 復(fù)篩實(shí)驗(yàn)

從經(jīng)過(guò)初篩后培養(yǎng)的菌落中挑出長(zhǎng)勢(shì)較好的菌種，采用分區(qū)劃線法接入YPD 培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)24 h，對(duì)菌種進(jìn)行進(jìn)一步分離純化培養(yǎng)，篩選出生長(zhǎng)較好的酵母菌進(jìn)行鏡檢[4-5]。

1.2.3 鏡檢

通過(guò)染色劑的染色對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行光學(xué)顯微鏡的鏡檢，并通過(guò)熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)酵母菌的形態(tài)觀察

2.1.1 酵母菌菌落的觀察

通過(guò)對(duì)曲粉的初篩和復(fù)篩后得到兩株的酵母菌F1 與F2，酵母菌落形態(tài)各有不同，從而在外觀上判定有大致的方向，其菌落形態(tài)特征如下表1。

表1 酵母菌菌落形態(tài)觀察

兩株菌落在生長(zhǎng)過(guò)程中具有明顯的生態(tài)學(xué)特征，并且差異較大，F(xiàn)1 菌體具有光澤圓潤(rùn)的菌落，是典型的產(chǎn)酯酵母菌。產(chǎn)酯酵母對(duì)乙醇親和力很強(qiáng)，以乙醇作碳源能發(fā)育很好，而且又有較強(qiáng)的氧化特性，在生產(chǎn)白酒時(shí)，可以利用產(chǎn)酯酵母提高酒的主體香含量，如乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等，以及乙酸甲酯、辛酸乙酯等次要香味物質(zhì)，是形成白酒的主體風(fēng)味物質(zhì)[6]。

2.1.2 酵母菌的個(gè)體觀察

通過(guò)涂布平板，劃線法對(duì)培養(yǎng)的菌株進(jìn)行分離純化，將篩選出來(lái)的經(jīng)過(guò)感官評(píng)定和形態(tài)觀察后的酵母菌F1 與F2 分別進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行鏡檢，鏡檢用油鏡觀察，鏡檢酵母菌形態(tài)描述見(jiàn)表2。

表2 酵母菌個(gè)體觀察

圖1 酵母菌的形態(tài)

圖1結(jié)果顯示，菌落形態(tài)較大較厚，出現(xiàn)乳白色或紅色菌體，表面濕潤(rùn)、粘稠，易被挑起。具有芽體，形成成串的細(xì)胞。從大曲粉中分離純化得到的酵母菌呈卵圓形、圓形或檸檬形，通過(guò)熒光倒置顯微鏡的檢驗(yàn)，酵母菌菌落個(gè)體較大，形狀為橢球狀，菌種生活壯實(shí)[7];而F2 菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了易風(fēng)干的特性，因此，在今后的實(shí)際應(yīng)用中，需要注意對(duì)F2 菌株進(jìn)行保濕貯藏。

2.2 對(duì)兩株酵母菌的生化指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1 發(fā)酵液中pH 值的測(cè)定

現(xiàn)將F1 與F2 酵母菌接種至制備好的三角發(fā)酵瓶中，做平行樣，分別為F1-1，F(xiàn)1-2，F(xiàn)1-3 和F2-1，F(xiàn)2-2，F(xiàn)2-3 放入28 ℃搖床進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵進(jìn)行1 d對(duì)其進(jìn)行取樣測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 pH 值的變化情況

從所示數(shù)據(jù)可以看出，適宜酵母菌生長(zhǎng)的pH范圍為4.0 ～6.0。酵母菌F1 在1 ～3 d 的pH 值處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，偏酸性，適宜酵母菌的生長(zhǎng);第4 d、第5 d 處于上升狀態(tài)，中性偏堿性，不太適宜酵母菌的生長(zhǎng)，這個(gè)過(guò)程中也可能是隨著細(xì)胞代謝的作用下培養(yǎng)基中有機(jī)酸等物質(zhì)被酵母菌利用，致使酸性物質(zhì)減少[8]，出現(xiàn)pH 值上升的現(xiàn)象;同時(shí)，F(xiàn)1 酵母發(fā)酵液在發(fā)酵的第3 d 時(shí)產(chǎn)生一定的酯香味。同樣，在對(duì)F2 酵母菌的發(fā)酵液測(cè)定得到的結(jié)果是pH 值一直處于逐漸上升狀態(tài)，其發(fā)酵液中酯香味較濃，可能是代謝過(guò)程中的酸性物質(zhì)利用率較高，致使酸性物質(zhì)和醇相結(jié)合轉(zhuǎn)化出大量酯類(lèi)物質(zhì)。

2.2.2 發(fā)酵中殘?zhí)呛康臏y(cè)定

將放入搖床培養(yǎng)的發(fā)酵液每天進(jìn)行一次取樣，測(cè)定在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌對(duì)糖分的利用的變化情況，以發(fā)酵液中殘?zhí)呛康淖兓癁橹笜?biāo)，詳細(xì)殘?zhí)亲兓闆r見(jiàn)表4。

表4 發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛康淖兓?/p>

由表4中可看出F1-1 號(hào)瓶中殘?zhí)堑暮枯^高，殘?zhí)浅掷m(xù)消耗，到第5 d 時(shí)還有少許殘?zhí)堑拇嬖?F1-2號(hào)與F1-3 號(hào)瓶中第1 ～2 d 有殘?zhí)谴嬖?，隨著殘?zhí)侵饾u消耗，到第3 ～5 d 時(shí)已無(wú)殘?zhí)谴嬖?而F2-1 號(hào)與F2-2 號(hào)瓶中第1 ～2 d 有殘?zhí)谴嬖?，到? d 殘?zhí)窍耐?。這個(gè)過(guò)程說(shuō)明在在發(fā)酵過(guò)程中，在厭氧環(huán)境中經(jīng)過(guò)糖酵解途徑( EMP) 將葡糖降解成丙酮酸，然后脫羧生成乙醛，在乙醇脫氫酶催化下還原成大量乙醇[9]。因此，酵母菌的代謝情況比較旺盛，對(duì)發(fā)酵液中糖分的分解速度很快，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中需要及時(shí)填補(bǔ)料，從而保證發(fā)酵的有效進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

大曲酒是白酒中一種主導(dǎo)香型，濃郁的酒香和大曲中的各種微生物密切相關(guān)，了解大曲中酵母菌種類(lèi)，對(duì)于深入探究白酒的釀造機(jī)理具有積極意義。本文采用酵母菌的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)的方法從曲粉中獲得兩株酵母菌，菌落乳白色，濕潤(rùn)光滑有光澤，具有明顯酯香味，是典型的釀酒酵母特征[10]。在通過(guò)重要生理生化指標(biāo)的測(cè)定后得知，F(xiàn)1 酵母菌在培養(yǎng)1 ～3 d 時(shí)進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，繁殖能力較強(qiáng)，生長(zhǎng)速度較快，此時(shí)，將大曲投入到白酒生產(chǎn)中，能迅速繁殖到發(fā)酵所需數(shù)量，充分利用原料，提高發(fā)酵程度; 當(dāng)pH 值為4.5 ～6.5 時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較好，殘?zhí)呛枯^多。

F2 酵母菌在培養(yǎng)1 ～2 d 時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)，pH 值為6.5 ～7.0 時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，對(duì)糖分消耗量開(kāi)始增加，使得發(fā)酵液中殘?zhí)呛繙p少，說(shuō)明在這個(gè)階段，酵母菌開(kāi)始轉(zhuǎn)入發(fā)酵期，此時(shí)，對(duì)發(fā)酵池的各項(xiàng)培養(yǎng)條件要進(jìn)行時(shí)時(shí)觀測(cè)，確保發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行; 其發(fā)酵液中酯香味較濃重，推測(cè)是代謝過(guò)程中的酸性物質(zhì)利用率較高，轉(zhuǎn)化出大量酯類(lèi)物質(zhì)，但是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，酵母菌在釀造過(guò)程中表現(xiàn)出很強(qiáng)的乙醇形成能力，還可以產(chǎn)生丁醇、戊醇、乙酸戊酯等揮發(fā)性化合物，對(duì)白酒的香型形成產(chǎn)生重要影響。因此，在白酒大曲中分離并研究相關(guān)產(chǎn)酯酵母在實(shí)際生產(chǎn)中具有一定的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

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