倪興軍，薛仰全，余四九

(1.甘肅酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅酒泉 735000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

影響奶牛超數(shù)排卵效果因素的分析與研究

倪興軍1，薛仰全1，余四九2

(1.甘肅酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅酒泉 735000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

[目的]為了充分利用優(yōu)良母牛遺傳資源，發(fā)揮超數(shù)排卵技術(shù)對(duì)改良奶牛品種的重要作用。[方法]本試驗(yàn)采用CUE-MAT孕酮栓+FSH+PGF2α法和自然發(fā)情+FSH+PGF2α法對(duì)酒泉地區(qū)飼養(yǎng)奶牛進(jìn)行超數(shù)排卵研究，重點(diǎn)就不同激素處理、季節(jié)、供體母牛體況、胎次等單一因素對(duì)超排效果影響進(jìn)行觀察，[結(jié)果]表明:春季(4.00)<秋季平均可用胚數(shù)(4.86)<冬季平均可用胚數(shù)(5.07)。平均可用胚率：秋季(56.04%)>冬季(50.71%)>春季(43.54%)。春、秋兩季在可用胚率上差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.024<0.05)，春、冬兩季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.223>0.05)，秋、冬季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.342>0.05)。經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛平均可用胚數(shù)分別為9.06和9.65，平均可用胚率分別為55.83%、56.48%。經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛可用胚率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.902>0.05)，但青年母牛的超排效果略高于經(jīng)產(chǎn)母牛。[結(jié)論]為當(dāng)?shù)貜氖鲁瑪?shù)排卵工作提供基礎(chǔ)性參考資料。

奶牛；超數(shù)排卵；影響因素

目前，在生產(chǎn)上超數(shù)排卵技術(shù)的效果往往受多種因素影響，如激素處理方法、供體的營(yíng)養(yǎng)狀況、季節(jié)、環(huán)境因素、遺傳性狀等，導(dǎo)致了超數(shù)排卵效果差異較大，也嚴(yán)重阻礙了該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用[1]。本文從激素處理、季節(jié)、供體牛營(yíng)養(yǎng)狀況及年齡等方面，系統(tǒng)的探討了單一因素對(duì)奶牛超數(shù)排卵效果的影響，為提高超數(shù)排卵效果提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供體牛的選擇與飼養(yǎng)

供體牛是從甘肅祁牧乳業(yè)有限責(zé)任公司、酒泉市雄鵬乳業(yè)有限責(zé)任公司的高產(chǎn)荷斯坦奶牛群中選取的，體質(zhì)健康、膘情中上，無(wú)生殖系統(tǒng)疾病、傳染病和寄生蟲病，有正常的發(fā)情周期。按奶牛的日常飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼喂管理,保證充足的維生素和微量元素(如注射VA、VD、VE，冬季每日補(bǔ)充胡蘿卜2kg)，單獨(dú)組群、編號(hào)，保持飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。

1.2 主要試驗(yàn)藥物與儀器設(shè)備

1.2.1 主要試驗(yàn)藥物 FSH(100單位×10支,獸藥字(2007)110044648)：寧波市三生藥業(yè)有限公司；PGF2α(0.2 mg/2mL/瓶、批號(hào)000513)：上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所；CUE-MATE孕酮栓(1.56 g/支,10支/合，為CIRD第二代產(chǎn)品)：加拿大貝爾尼奇獸藥廠生產(chǎn); 杜氏磷酸緩沖液(PBS)：自制(按奶牛胚胎移植技術(shù)規(guī)程 NY/T1445-2007的標(biāo)準(zhǔn)要求)。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 保定架、移植槍、滅菌塑料硬外套及軟外套、剪毛剪、高壓滅菌鍋、冷凍儀(日本)、連續(xù)變倍體視顯微鏡(北京泰克)、二通管(日本產(chǎn)沖胚管)、沖胚器(50m1注射器)、集卵杯(φ9塑料平皿)等。

1.4 超排方法

方法Ⅰ：CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2a法(以下簡(jiǎn)稱孕酮栓法) 在發(fā)情周期的任何1 d(除發(fā)情當(dāng)日)，將CUE-MATE孕酮栓置入陰道內(nèi)，該天計(jì)為0 d，從第4天開(kāi)始連續(xù)4 d，按照逐天遞減的方法注射FSH，共計(jì)400單位/頭(用10 mL 0.9%生理鹽水充分稀釋,早、晚對(duì)半肌注；注射第1天的劑量為總劑量的40%，以后每天遞減10%)，在注射FSH的第4天的早、晚注射PGF2α 0.4 mg/頭，第9天取出 CUE-MATE栓，第10～13天觀察發(fā)情。

方法Ⅱ：自然發(fā)情+FSH+PGF2α法(簡(jiǎn)稱自然發(fā)情法) 母牛發(fā)情后9～12 d開(kāi)始連續(xù)4 d按照逐天遞減的方法注射FSH(用法同上)，共計(jì)400 mg/頭，在注射FSH的第4天的早、晚注射PGF2α 0.4 mg/頭，之后觀察發(fā)情。

1.5 人工授精

在供體牛安靜接受爬跨后第1次輸精，12 h后第2次輸精，每次輸精為2支。發(fā)情日記為第0天，在第7天采用非手術(shù)法沖胚。

1.6 胚胎的回收采集

供體牛超排發(fā)情后的第7天采用二路沖卵管法進(jìn)行非手術(shù)沖卵。用側(cè)漏式集卵杯在顯微鏡下檢胚。二次檢查用PBS液沖洗集卵杯2-3次，清洗后再鏡檢、回收胚胎。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS Statistics17.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 不同超排處理方法超數(shù)排卵效果的比較

本試驗(yàn)結(jié)果表明，如表1所示。自然發(fā)情法和孕酮栓法超排回收的平均可用胚胎數(shù)分別為4.54枚和4.86枚，可用胚率分別為55.05%和56.04%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.846>0.05)，但孕酮栓法的超排效果略高于自然發(fā)情法。

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)狀況供體牛超數(shù)排卵效果的比較

本試驗(yàn)挑選膘情上、中、下3 等共47頭高產(chǎn)荷斯坦奶牛，用孕酮栓法進(jìn)行超排處理，結(jié)果表明，如表2所示。上、中、下3等膘情供體牛獲得的平均可用胚胎數(shù)分別為6.13、5.39、3.29，可用胚率分別為58.60%、58.08%、44.66%。下等體況的供體牛與上、中等體況的供體牛在可用胚率上差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.028<0.05，P=0.032<0.05)，而上等體況和中等體況供體牛在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.925>0.05)。

表1 不同激素處理方案對(duì)供體牛超數(shù)排卵效果的影響(頭、枚、%)

表2 供體牛營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)超數(shù)排卵效果的影響(頭、枚、%)

注： 表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母者表示差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。

2.3 不同季節(jié)供體牛超數(shù)排卵效果的比較

本試驗(yàn)選擇膘情適中高產(chǎn)荷斯坦奶牛51頭，采用孕酮栓法進(jìn)行超排處理，結(jié)果表明，見(jiàn)表3。平均可用胚數(shù)：春季(4.00)<秋季平均可用胚數(shù)(4.86)<冬季平均可用胚數(shù)(5.07)。平均可用胚率：秋季(56.04%)>冬季(50.71%)>春季(43.54%)。春、秋兩季在可用胚率上差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.024<0.05)，春、冬兩季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.223>0.05)，秋、冬季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.342>0.05)。

2.4 不同年齡供體牛超數(shù)排卵效果的比較

本試驗(yàn)分別選擇膘情適中的高產(chǎn)荷斯坦經(jīng)產(chǎn)母牛(2～6胎)18頭、青年母牛(1.5～2歲未產(chǎn)牛犢)20頭，采用孕酮栓法進(jìn)行超排處理(結(jié)果見(jiàn)表4)。結(jié)果表明，經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛平均可用胚數(shù)分別為9.06和9.65，平均可用胚率分別為55.83%、56.48%。經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母?？捎门呗手g差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.902>0.05)，但青年母牛的超排效果略高于經(jīng)產(chǎn)母牛。

表3 季節(jié)對(duì)超排效果的影響(頭、枚、%)

注： 表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母者表示差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，有相同字母表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

表4 經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛超排效果的比較(頭、枚、%)

3 討論

3.1 不同超排處理方法對(duì)供體牛超數(shù)排卵效果的影響

超數(shù)排卵是在雌性哺乳動(dòng)物發(fā)情的適當(dāng)時(shí)間，注射外源促性腺激素，使卵巢比自然發(fā)情時(shí)有更多的卵泡發(fā)育并排卵的一種方法，簡(jiǎn)稱“超排”。通過(guò)外源性激素的注入，可提高血液中促性腺激素濃度，降低發(fā)育卵泡的閉鎖，增加早期卵泡發(fā)育到成熟卵泡的數(shù)量，從而使雌性動(dòng)物每次排卵數(shù)目增加。促卵泡素(FSH)是一種較常用的超排激素，是由腺垂體嗜堿性粒細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白激素，其生理作用是促進(jìn)卵泡的成熟發(fā)育、刺激卵巢生長(zhǎng)及增加卵巢的重量，由于其在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期短(不足180 min)，因此需要多次注射[2]

吳亦方等采CUE-MATE法和自然發(fā)情法對(duì)荷斯坦奶牛進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果表明，CUE-MATE法和自然發(fā)情法平均獲得的可用胚胎數(shù)分別為4.81和5.08枚，二者差異不顯著( P>0.05)，CUE-MATE 法和自然發(fā)情法的可用胚率分別為58.52%和57.92%，差異也不顯著( P>0.05)[3]。李金輝等[4]用FSH+PG法處理供體牛獲得頭均可用胚數(shù)4.2枚左右，劉俊平等[5]用FSH+PG+GnRH法處理供體牛獲得頭均可用胚數(shù)6.2枚左右，喬海生等\%[6]用CIRD+GnRH+FSH+PG法處理供體牛獲可用胚數(shù)為5.4～8.8枚。說(shuō)明不同超排方法的超排效果不同。

本試驗(yàn)在相同飼養(yǎng)條件下，分兩組分別采用CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2a法和自然發(fā)情+FSH+PGF2α法對(duì)受體牛進(jìn)行超數(shù)排卵處理。結(jié)果表明，自然發(fā)情法和CUE-MATE法超排回收的平均可用胚胎數(shù)分別為4.54枚和4.86 枚，CUE-MATE法的超排效果略高于自然發(fā)情法；CUE-MATE法和自然發(fā)情法超排的可用胚率分別為55.05%和56.04%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義 (P=0.846>0.05)，但CUE-MATE法的可用胚率略高于自然發(fā)情法，與吳亦方等的研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)未達(dá)到了國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)報(bào)道的6枚水平[7]。

3.2 不同營(yíng)養(yǎng)狀況供體牛對(duì)超數(shù)排卵效果的影響

供體牛的營(yíng)養(yǎng)狀況是影響其超排反應(yīng)的重要因素，因?yàn)轶w質(zhì)好的牛卵巢機(jī)能好，排卵多；而體質(zhì)差的母牛，排卵較少。Prakash等[8]認(rèn)為，供體體況對(duì)超排反應(yīng)和回收胚胎數(shù)量有顯著影響，體況差的牛導(dǎo)致并加劇黃體的早期退化(發(fā)情后6～8 d)，影響超排的效果，使供體的胚胎發(fā)生退化，甚至回收不到胚胎。朱玉林認(rèn)為[9]，只要是超排時(shí)母牛處于增重過(guò)程中(能量正平衡狀況)，選擇膘情偏瘦的牛做供體不影響超排效果。

本實(shí)驗(yàn)證明，用CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2α法進(jìn)行超排處理，上、中、下3等膘情供體牛獲得的平均可用胚胎數(shù)分別為6.13、5.39、3.29，可用胚率分別為58.60%、58.08%、44.66%，也說(shuō)明了供體牛營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)超排效果有影響。下等體況的供體牛與上、中等體況的供體牛在可用胚率上差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.028<0.05，P=0.032<0.05)，而上等體況和中等體況供體牛在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.925>0.05)。

3.3 不同季節(jié)對(duì)供體牛超數(shù)排卵效果的影響

季節(jié)是個(gè)籠統(tǒng)的概念，它產(chǎn)生的影響實(shí)際上是氣溫、濕度、氣流、光照等自然條件的影響，以及隨之而來(lái)的飼料類型和日糧組成的改變。研究表明，季節(jié)和環(huán)境的變化會(huì)顯著影響超排效果。即使在同一季節(jié)，氣候條件、營(yíng)養(yǎng)水平不同，動(dòng)物的感受刺激也不盡相同，它們影響動(dòng)物的超排效果。一般的說(shuō)，嚴(yán)寒、酷熱均對(duì)家畜造成應(yīng)激，這些極端刺激對(duì)生理的不良影響會(huì)作用于生殖內(nèi)分泌軸，繼而影響到發(fā)情和排卵[10]。

張俊功等研究表明，魯西黃牛不同季節(jié)超數(shù)排卵獲可用胚差異不顯著(P>0.05)，但胚胎可用率冬季高于春、秋兩季(P<0.01)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2α法進(jìn)行超排處理，平均可用胚數(shù)：春季(4.00)<秋季平均可用胚數(shù)(4.86)<冬季平均可用胚數(shù)(5.07)。平均可用胚率：秋季(56.04%)>冬季(50.71%)>春季(43.54%)。春、秋兩季在可用胚率上差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.024<0.05)，春、冬兩季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.223>0.05) ，秋、冬季在可用胚率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義( P=0.342>0.05)。本試驗(yàn)與張俊功等研究結(jié)果不同，可能是南北不同區(qū)域氣候原因造成的。

3.4 不同年齡供體牛對(duì)超數(shù)排卵效果的影響

隨著年齡的增長(zhǎng)，家畜的卵巢機(jī)能減退或萎縮，超排效果也會(huì)日趨不明顯。供體母畜應(yīng)為2～4胎的青壯年健康經(jīng)產(chǎn)母牛的超排效果較好[12]。喬利敏等[13]認(rèn)為，供體母畜應(yīng)為青壯年母畜，至少有1胎以上的正常繁殖史，一般情況下不宜對(duì)無(wú)繁殖史的青年母?；蜻^(guò)老的母牛進(jìn)行超排。青年母牛經(jīng)超排處理后，排卵數(shù)和胚胎回收率均高于經(jīng)產(chǎn)母牛，這可能是由于青年母牛對(duì)超排藥物敏感性高的緣故。

丁紅[14]的試驗(yàn)說(shuō)明，年輕母羊?qū)に胤磻?yīng)的敏感性強(qiáng)于老齡母羊，因此選3～4歲母羊作供體為宜，5歲以上母羊超排效果趨于下降。胎次對(duì)超排的影響也是非常重要的。1～3胎隨著胎次的增加平均排卵數(shù)增加，3～8胎則隨胎次增高平均排卵數(shù)下降。

本實(shí)驗(yàn)采用CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2α法對(duì)經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛進(jìn)行超排處理，平均可用胚數(shù)分別為9.06和9.65，平均可用胚率分別為55.83%、56.48%。經(jīng)產(chǎn)母牛和青年母牛兩者的可用胚率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.902>0.05)，但青年母牛的超排效果略高于經(jīng)產(chǎn)母牛。但本研究發(fā)現(xiàn)青年母牛超排所獲可用胚胎數(shù)與經(jīng)產(chǎn)母牛相比無(wú)明顯差異，可能是由于本試驗(yàn)所用的青年母牛在1.5～2.0歲，其生殖系統(tǒng)和機(jī)能發(fā)育完成，同時(shí)青年母牛對(duì)激素應(yīng)答反應(yīng)敏感，故而1.5～2.0歲青年母牛超排效果與經(jīng)產(chǎn)牛超排效果差異較小。

由此可見(jiàn)，酒泉地區(qū)在未來(lái)的奶牛超數(shù)排卵或胚胎生產(chǎn)中，超數(shù)排卵技術(shù)可采用CUE-MATE孕酮栓+FSH+PGF2α法進(jìn)行超排處理，供體母?？蛇x取2～6胎經(jīng)產(chǎn)母?；?.5～2.0歲未產(chǎn)青年母牛均可，膘情體況在中等以上，在秋、冬季節(jié)進(jìn)行超排處理，效果理想。

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Affecting Factors Analysis of Superovulation in Dairy Cow

NI Xin-jun, XUE Yang-quan, YU Si-jiu

(1.JiuquanVocationalandTechnicalCollege，Jiuquan，Gansu735000;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070)

【Objective】To make full use of genetic resources of the excellent cow, superovulation technology applied in dairy cow was studied.【Method】 Two different methods was used. The first one (CUE-MAT progesterone suppository +FSH+PGF2α) was calleded as experiment group, and the second one (natural estrus +FSH+PGF2α) was called as control group. Both were studied in the superovulation of dairy cow in Jiuquan area. The observed factor affecting superovulation included the different hormone treatments, season, body condition of the cow and parity the number of accouterments.【Result】The result indicated that the number of available embryos in spring (4.00) was less than that in autumn (4.86), and both of them were less than the number of available embryos in winter (5.07). The average rate of embryo available of fall (56.04%) was higher than that of winter (50.71%) and spring (43.54%). The available embryo rate of spring and autumn season showed significant difference (P= 0.024). Available embryo rate of spring and winter demonstrated similar (P = 0.223). There was no statistically significant difference in rate of available embryos of autumn and winter (P=0.342). The average number of available embryos were 9.06 and 9.65, respectively, and the average available embryo rate of 55.83% and 56.48%, respectively. There was no statistically significant difference between the available embryo rate of the cows and young cow (P=0.902). However, the effect of super row in young cow was slightly higher than the cows.【Conclusion】The above experiment data could provide some basic reference data for superovulation in local area.

Cow; Superovulation; Influencing factors

中國(guó)牛業(yè)科學(xué)2015，41(1)：46?49ChinaCattleScience科學(xué)試驗(yàn)

2014-10-16

2014-11-20

倪興軍(1975-)，男, 甘肅酒泉人, 碩士，講師,主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)教學(xué)與科學(xué)研究工作。E-mail: nixingjun@jqzy.com

S823

A

1001-9111(2015)01-0042-04