程志芳，韓婭楠，董曉宇，常曉軻，姚秋菊

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

辣椒（Capsicum annuumL.）屬于茄科辣椒屬蔬菜，為異花授粉植物。按照傳統(tǒng)育種方法，培育一個自交系至少需要5 代，周期長，費時費力，而通過辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)僅通過1～2 代即可得到純合二倍體材料，縮短了育種年限，同時提高選擇效率，增加遺傳類型，甚至篩選到突變體[1]。自1964 年印度學(xué)者Guha 和Maheshwari[2]通過毛曼陀蘿的花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株以來，花藥培養(yǎng)獲得突破性進展。1973 年，王玉英等[3]和George 等[4]首次成功獲得了C.annuum辣椒花藥培養(yǎng)的再生植株。之后很多學(xué)者對如何提高辣椒花藥培養(yǎng)效率進行了研究。但大多集中在花蕾預(yù)處理方法[5-6]、外植體消毒方法[7-8]、培養(yǎng)基選擇[9-12]、碳源選擇[13]和激素組合[13-17]應(yīng)用上。而在激素組合應(yīng)用方面多是利用NAA 與KT 組合進行辣椒花藥培養(yǎng)，且許多研究者[13，18-19]認為0.5 mg·L-1NAA 與1.0 mg·L-1KT 組合最適合辣椒花藥培養(yǎng)。另有前人研究表明，2，4-D 和KT 組合在花藥培養(yǎng)中亦可直接誘導(dǎo)出胚狀體[20-21]。而在辣椒花藥培養(yǎng)方面，針對2，4-D 對辣椒花藥培養(yǎng)的影響研究較少。僅有的少量相關(guān)研究結(jié)果表明[6，22-23]，低濃度的2，4-D 與KT 組合可誘導(dǎo)辣椒花藥產(chǎn)生胚狀體。筆者以15 個不同類型的辣椒品種為試材，采用MS 培養(yǎng)基，比較了不同品種、2，4-D或NAA 與KT 激素組合以及預(yù)處理時間對辣椒花藥培養(yǎng)的影響，旨在為提高辣椒花藥培養(yǎng)效率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的15 個不同類型的辣椒品種見表1。于2020 年1 月底播種，4 月下旬定植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地露地試驗區(qū)。5 月中下旬至6 月中下旬采摘初花期和盛花期花蕾，上午8：00左右取樣，選取萼瓣等長或花瓣稍露出花萼的花蕾（此時小孢子大部分處在單核靠邊期），4 ℃低溫預(yù)處理1～7 d。將經(jīng)過預(yù)處理的花蕾，在超凈工作臺上用70%乙醇浸泡消毒30 s，再用0.1%HgCl2浸泡10 min，無菌水沖洗4～5 次。置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用鑷子和解剖刀剝開花蕾，取出花藥，接種在培養(yǎng)基上，用para-film 封口。32 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d，之后26 ℃下暗培養(yǎng)至有胚狀體長出，將其轉(zhuǎn)入無任何添加物的MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為26 ℃，光周期為12 h·d-1，直至其分化成苗。

表1 供試辣椒的品種和類型

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計方法，探究了品種、激素和預(yù)處理時間3 個因素對辣椒花藥培養(yǎng)的影響。每處理2～3 皿，每皿接種30 個花藥，3 次重復(fù)。所有試驗以MS 為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g·L-1蔗糖，4.0 mg·L-1AgNO3，3.0 g·L-1活性炭和8.0 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH 值為5.8。

1.2.1 品種篩選 將上述15 個不同類型辣椒品種的花藥接種在m2培養(yǎng)基（MS+1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）上，篩選出花藥培養(yǎng)效率較高的品種。

1.2.2 不同激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基 將前期篩出的高效品種的花藥接種于m1、m2、m3等3 種培養(yǎng)基上。m1、m2、m3等3 種培養(yǎng)基的外源激素種類及其濃度見表2，從中篩選出適用品種較多的高效培養(yǎng)基配方。

表2 培養(yǎng)基中添加的激素種類及濃度

1.2.3 不同預(yù)處理時間 以華之秀2 號的花藥為試材，分別經(jīng)歷1、2、3、4、5、6、7 d 的4 ℃低溫預(yù)處理后接種于m3培養(yǎng)基上。

1.2.4 指標測定 接種20 d 后每周調(diào)查1 次胚狀體萌發(fā)狀況，直至接種后80 d 統(tǒng)計出胚率、成苗率和畸形胚率。對于試驗中出現(xiàn)的類似根毛的胚狀體，轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基后只分化成根或少量的莖，均不能成苗，因此未列為胚狀體進行統(tǒng)計分析。

出胚率/%=（出胚數(shù)/接種花藥數(shù)）×100；成苗率/%=（成苗數(shù)/接種花藥數(shù)）×100；畸形胚率/%=[（出胚數(shù)-成苗數(shù)）/出胚數(shù)]×100；根毛胚率/%=（根毛胚個數(shù)/接種花藥數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS（9.01）軟件進行完全隨機設(shè)計單因素試驗方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種對辣椒花藥培養(yǎng)的影響

由表3 可知，在參試的15 個辣椒品種中有9個品種出胚，出胚率為0.37%～4.44%，7 個品種成苗，成苗率為0.56%～2.25%。不同品種的出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率有一定差異。在出胚率方面，短指椒品種中順808 和PC447 最高，達4.44%；其與華之秀2 號（3.42%）和新時代（2.96%）差異不顯著，但顯著高于其他參試基因型的出胚率。博辣艷麗和無名線椒出胚率均為1.67%，豫園大椒F1和一品特大椒、美辣華之秀出胚率依次降低，而金螺三號、豫園巨椒、豫藝鮮辣128、黃線椒、貴州朝天椒和豐抗二號6 個品種未出胚。在成苗率方面，華之秀2 號成苗率最高，為2.25%，中順808 和PC447 成苗率均為2.22%，3 個基因型之間成苗率差異不顯著，與博辣艷麗（1.67%）和新時代（1.30%）的成苗率差異也不顯著，但顯著高于其他參試基因型的成苗率。豫園大椒F1和一品特大椒成苗率最低，均為0.56%。在畸形胚率方面，博辣艷麗和一品特大椒無畸形胚，全部成苗；華之秀2 號的畸形胚率為34.13%；中順808、PC447 和豫園大椒F1的畸形胚率均為50.00%，新時代畸形胚率為55.56%，而無名線椒和美辣華之秀均為畸形胚。參試的15 個品種中9 個品種誘導(dǎo)出根毛胚，根毛胚率有一定差異，從高到低依次為一品特大椒、豫園大椒F1、新時代、豫園巨椒、華之秀2 號、豫藝鮮辣128、金螺三號、中順808 和美辣華之秀，最高為3.33%，最低為0.37%。綜上，參試的15 個品種中，華之秀2 號、中順808、新時代、PC447 和博辣艷麗5 個品種成苗率較高，且這5 個品種在根毛胚率方面，除新時代較高（2.96%）外，其他4 個品種根毛胚率較低或無根毛胚。由此可知，這5 個品種花藥培養(yǎng)效率最高。

表3 不同品種辣椒花藥培養(yǎng)效率的比較

2.2 不同激素對辣椒花藥培養(yǎng)的影響

由表4 可知，由不同種類及濃度的外源激素組成的3 種培養(yǎng)基對參試5 個辣椒品種花藥培養(yǎng)效率的影響有一定差異。華之秀2 號在3 種培養(yǎng)基上的出胚率和根毛胚率差異均顯著。在出胚率方面，3 種培養(yǎng)基出胚率表現(xiàn)為m3＆gt;m2＆gt;m1。在成苗率方面，m3成苗率最高，m3與m2培養(yǎng)基差異不顯著，但二者均顯著高于m1。m3出胚率、根毛胚率均顯著高于m2，畸形胚率也高于m2，但根毛胚和畸形胚不能成苗。由此可知，m2培養(yǎng)基最適合華之秀2 號進行花藥培養(yǎng)。中順808 在3 種培養(yǎng)基上的成苗率和根毛胚率差異均不顯著，m1出胚率和畸形胚率均與m3差異顯著，但與m2差異不顯著。m1出胚率和成苗率均最高，畸形胚率略低于m2，且3 種培養(yǎng)基上根毛胚率差異不顯著。由此可知，m1培養(yǎng)基最適合中順808 花藥培養(yǎng)。新時代在3 種培養(yǎng)基上根毛胚率和畸形胚率差異均不顯著。m1和m2出胚率均顯著高于m3，但m1與m2差異不顯著；m2成苗率高于m1和m3，且m2與m3差異顯著，但與m1差異不顯著；m2根毛胚率和畸形胚率均最低。由此可知，m2培養(yǎng)基最適合新時代花藥培養(yǎng)。博辣艷麗在3種培養(yǎng)基上出胚率無顯著差異，其中，m1出胚率最高，達2.22%，但成苗率為0.00%，均為畸形胚。m2出胚率雖略低于m1，但成苗率最高，為1.67%，且無畸形胚；3 種培養(yǎng)基上均無根毛胚萌發(fā)。由此可知，m2培養(yǎng)基最適合博辣艷麗花藥培養(yǎng)。PC447 在3 種培養(yǎng)基上均無根毛胚萌發(fā)，m2出胚率和成苗率分別達4.44%、2.22%，均顯著高于其他2 種培養(yǎng)基。由此可知，m2培養(yǎng)基最適合品種PC447 花藥培養(yǎng)。綜上分析，除中順808 在m1上的辣椒花藥效率較高以外，其他4 個品種均在m2上培養(yǎng)效果最好。由此可知，m2是辣椒花藥培養(yǎng)時適用品種較廣泛的培養(yǎng)基配方。

表4 不同激素組合對不同品種辣椒花藥培養(yǎng)的影響

2.3 不同預(yù)處理時間對辣椒花藥培養(yǎng)的影響

由表5 可以看出，將華之秀2 號分別進行1、2、3、4、5、6 和7 d 的4 ℃預(yù)處理后接種在m3培養(yǎng)基（出胚率較高）上，預(yù)處理時間為3 d 時，由于接種時人為操作不當造成全部污染，故不予統(tǒng)計。其余各處理出胚率、成苗率和根毛胚率均有一定差異，畸形胚率差異不顯著。出胚率和成苗率均呈現(xiàn)出隨預(yù)處理時間延長先升高后降低趨勢。預(yù)處理2 d 時出胚率和成苗率均最高，分別為10.00%和6.67%，4 d 時出胚率和成苗率顯著降低，當預(yù)處理7 d 時出胚率和成苗率均最低，分別為1.11%和0.56%。根毛胚率方面未發(fā)現(xiàn)與出胚率和成苗率相似規(guī)律，表明預(yù)處理時間長短不是根毛胚萌發(fā)的主要因素。綜上所述，當花蕾經(jīng)歷2 d 的4 ℃預(yù)處理后，出胚率和成苗率均顯著高于其他預(yù)處理時間，培養(yǎng)效果最好。

表5 不同預(yù)處理時間對出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率的影響

3 討論與結(jié)論

筆者研究中參試的15 個不同類型辣椒品種有9 個出胚，出胚率0.37%～4.44%，7 個品種成苗，成苗率0.56%～2.25%。9 個出胚品種中5 個品種花藥培養(yǎng)效率較高，表明品種是影響辣椒花藥培養(yǎng)的重要因素。這與前人[10-11，13，22]的研究結(jié)論一致。另外，筆者研究中參試的4 個牛角椒品種3 個出胚，占比為75%，5 個線椒品種3 個出胚，占比60%；4 個短指椒品種2 個出胚，占比50%。表明不同類型辣椒花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出胚概率不同，牛角椒品種較易出胚。這與前人的研究結(jié)果類似，戈偉等[18]研究表明牛角椒與辣椒雜種一代為較易出胚品種；趙激等[10]認為大果型品種比小果型品種較易出胚。

辣椒花藥培養(yǎng)中激素種類及其配比一直是眾多學(xué)者研究的內(nèi)容。筆者的研究比較了2，4-D 與KT 組合（m2）、NAA 與KT 組合（m1）以及二者與KT 組合（m3）對辣椒花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT（m2）是辣椒花藥培養(yǎng)時適用品種較廣泛的培養(yǎng)基配方。因此，筆者研究認為2，4-D 與KT 組合較NAA 與KT 組合更有助于辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)。這與劉獨臣[24]的研究結(jié)論一致。但大多相關(guān)學(xué)者的研究集中在NAA 和KT 的研究[13，18-19]上，且認為NAA 比2，4-D 更適合辣椒花藥培養(yǎng)。分析可能與不同研究中使用基本培養(yǎng)基不同和采用的激素濃度不同有關(guān)。已有前人研究[25]表明，在茄子花藥培養(yǎng)方面，低濃度2，4-D 促進胚狀體產(chǎn)生，高濃度2，4-D 促進愈傷組織產(chǎn)生。而在辣椒花藥培養(yǎng)方面，前人[6，22，23]研究表明，0.005～0.100 mg·L-12，4-D與0.05～0.10 mg·L-1KT 組合有利于誘導(dǎo)辣椒花藥產(chǎn)生胚狀體。而筆者研究表明，高濃度2，4-D 和KT組合（1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）亦可廣泛用于誘導(dǎo)辣椒花藥產(chǎn)生胚狀體。這在劉獨臣[24]的研究中也有類似結(jié)論，且其研究表明，高濃度2，4-D 和KT 可促進出胚率較高的品種較快出胚，同時刺激在低濃度時不出胚的品種出胚。這表明高濃度的2，4-D 和KT 組合在不同作物的花藥培養(yǎng)中效果不同。

花藥接種前進行低溫預(yù)處理能顯著延長花藥壁和花粉的退化時間，同時在花藥壁中積累大量淀粉，為花粉的進一步發(fā)育提供營養(yǎng)[6]。筆者研究表明，4 ℃低溫預(yù)處理2 d 時，花藥培養(yǎng)效率最高，這與前人[13-14，26]的研究結(jié)論一致，但張?zhí)煜璧萚27]研究表明4 ℃低溫預(yù)處理24 h 效果最好。有學(xué)者[6]認為4 ℃低溫預(yù)處理3～5 d 對胚狀體的形成有較好的促進作用，但也有研究者發(fā)現(xiàn)[5]，低溫預(yù)處理對辣椒花藥胚誘導(dǎo)無任何促進作用，這可能是由于各個研究的采蕾季節(jié)和花期不同。因此，針對不同季節(jié)的辣椒花藥培養(yǎng)影響因素有待進一步研究。

筆者研究表明，品種是影響辣椒花藥培養(yǎng)的重要因素；MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-12，4-D、1.5 mg·L-1KT、4.0 mg·L-1AgNO3、3.0 g·L-1活性炭和30.0 g·L-1蔗糖較普遍適用于辣椒花藥培養(yǎng)胚誘導(dǎo)；4 ℃低溫預(yù)處理2 d 時最有利于辣椒花藥培養(yǎng)。