楊　娜，郭政飛，錢　錳，甘立軍，朱昌華

(南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，南京 210095)

根毛源于特定的表皮細胞，即生毛細胞,其發(fā)育過程分為3個階段，即根毛細胞的特化及起始、根毛由起始轉(zhuǎn)向頂端伸長、根毛迅速伸長直到完全成熟[1-2]。根毛是根系重要的組成部分，其存在增加了根系的表面積，不僅增強了植物吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的能力，而且有助于植物根系的固定，并為植物與一些真菌及共生細菌提供了相互作用的場所[3-4]。

根毛的發(fā)育受到植物激素生長素(auxin)和乙烯(ethylene)的調(diào)控。外源1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxyli, ACC，乙烯合成的前體)處理野生型擬南芥誘導異位根毛的產(chǎn)生(由非生毛細胞產(chǎn)生根毛)[5-7]，而乙烯合成抑制劑氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine, AVG)和乙烯作用抑制劑Ag+的處理則抑制根毛的產(chǎn)生[5,8]。CTR1 編碼一種Raf-like的蛋白激酶，它負調(diào)控乙烯的信號傳遞，突變體ctr1產(chǎn)生異位的根毛[9]。外源生長素處理根毛缺失型突變體rhd6，能夠恢復根毛的生長，而生長素相關的突變體aux1、axr1、axr2和axr3，根毛的發(fā)育均不正常[8-12]，說明生長素也是調(diào)控根毛發(fā)育的一種關鍵激素。研究發(fā)現(xiàn)，根毛細胞中過量表達生長素輸出載體抑制根毛的頂端伸長，又表明生長素的正確分布是根毛發(fā)育的必要條件[13-14]。

同時，根毛的發(fā)育還受到外界環(huán)境中礦質(zhì)元素的調(diào)控。例如，缺乏鐵、磷、鉀、錳和鎂均促進根毛的發(fā)育[15-19]。據(jù)報道活性氧(ROS )參與礦質(zhì)元素調(diào)控的根毛發(fā)育過程。例如，ROS參與缺氮誘導的擬南芥根毛伸長生長，不同濃度鎂對擬南芥根毛發(fā)育的調(diào)控依賴ROS的信號途徑[19-20]。生長素和乙烯也參與了礦質(zhì)營養(yǎng)對根毛發(fā)育的調(diào)控[14,21-22]。例如，生長素的極性運輸和信號傳遞參與低磷對擬南芥根毛發(fā)育的影響，而乙烯則參與多種礦質(zhì)元素缺乏對根毛發(fā)育的調(diào)控[20,22]。在低磷條件下，乙烯合成前體ACC促進根毛的伸長，而乙烯合成及作用抑制劑則抑制根毛的伸長。此外，缺鉀和缺硼調(diào)控的根毛發(fā)育也依賴乙烯的信號傳導途徑[18,21]。

目前，氮素調(diào)控根毛發(fā)育的報道較少，我們前期報道了高濃度銨引起根毛的分叉，這些分叉根毛多數(shù)都畸形發(fā)育，有些分叉產(chǎn)生于一個膨大的突起，有些分叉產(chǎn)生于正在伸長的根毛，引起根毛伸長停止，茉莉酸和乙烯在高銨誘導根毛分叉中發(fā)揮相反的作用[23]。在上述研究的基礎上，本試驗進一步探討了ROS、生長素和乙烯如何參與高濃度硝酸銨對根毛發(fā)育的調(diào)控。根毛是根系的重要組成部分，根毛發(fā)育畸形影響根系的吸收功能，本試驗通過研究高銨引起根毛畸形的機制及生長素和乙烯在此過程中的作用，不僅為生產(chǎn)上的合理施肥提供理論依據(jù)，同時也為生產(chǎn)上如何緩解銨毒害提供思路。

1　材料和方法

1.1　植物材料及生長條件

試驗所用的擬南芥野生型種子生態(tài)型為Columbia，突變體為乙烯不敏感型突變體etr1-1、和etr1-3，生長素不敏感突變體aux1-7和axr1-3，背景均為Columbia。

種子首先進行表面消毒。將種子放入70%(v/v)乙醇1 min，用去離子水洗4～5次。接著將其轉(zhuǎn)入到0.1%(v/v)HgCl25 min，然后用去離子水洗4～5次。將消毒后的種子播在培養(yǎng)基表面后在4 ℃黑暗條件下放置1 d去春化，然后將其轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件(晝/夜)為25 ℃/23 ℃、16 h /8 h。用熒光燈(日立，日本)提供光源，光強約為250 μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基包含5 mmol·L-1KNO3、2 mmol·L-1MgSO4、2 mmol·L-1Ca(NO3)2、2.5 mmol·L-1KH2PO4、70 μmol·L-1H3BO3、14 μmol·L-1MnCl2、1 μmol·L-1ZnSO4、0.5 μmol·L-1CuSO4、10 μmol·L-1NaCl、0.2 μmol·L-1Na2MoO4和40 μmol·L-1Fe-EDTA，培養(yǎng)液中加入1%(w/v)瓊脂、蔗糖(43 mmol·L-1)和Mes(4.7 mmol·L-1)，用KOH將pH調(diào)至5.8。培養(yǎng)4 d后將幼苗轉(zhuǎn)移到新的對照和處理培養(yǎng)基上繼續(xù)生長2 d，統(tǒng)計分叉根毛的數(shù)量或根毛的長度。處理培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基中去除5 mmol·L-1KNO3，所缺少的K+加入5 mmol·L-1KCl替代。NH4NO3處理時，根據(jù)不同處理濃度加入相應用量的NH4NO3。選擇固體培養(yǎng)基的優(yōu)勢是便于對根毛的觀察，培養(yǎng)皿垂直放置時，植物在培養(yǎng)基的表面生長，根毛能夠平鋪培養(yǎng)基表面，非常利于觀察和測定根毛的數(shù)量及長度。

1.2　植物激素及活性氧處理

吲哚乙酸(IAA)和萘乙酸(NAA)分別溶于一定量的乙醇中，然后用去離子水稀釋到1 mmol·L-1和0.01 mmol·L-1；ACC (Sigma)分別溶于去離子水中配制成母液1 mmol·L-1。所有這些試劑均在培養(yǎng)基溫度為45～50 ℃時加入。

二苯基氯化碘(diphenylene iodonium chloride，DPI，NADPH氧化酶的抑制劑，抑制活性氧的產(chǎn)生)和OH·處理：DPI(Sigma)溶于二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，配置濃度10 mmol·L-1貯液；處理時，將其稀釋至合適濃度的母液，按實驗所需處理濃度加入相應的母液到培養(yǎng)皿中，然后加入冷卻至45～50 ℃的相應用量的培養(yǎng)基，使新培養(yǎng)基含有實驗所需處理濃度的DPI，對照中加入等量的DMSO。ROS以OH·的形式給與，按照Foreman等[24]方法，OH·利用 2 mmol·L-1H2O2、0.2 mmol·L-1Ca2+和0.2 mmol·L-1抗壞血酸(ascorbate)混合而產(chǎn)生。處理時，將合適濃度的H2O2、Ca2+和抗壞血酸母液按實驗所需處理濃度加入相應的母液到培養(yǎng)皿中，然后加入冷卻至45～50 ℃的相應用量的培養(yǎng)基，使新培養(yǎng)基含有實驗所需處理濃度的OH·。

1.3　分叉根毛數(shù)和根毛長度的測定

1.3.1分叉根毛數(shù)將處理2 d的幼苗迅速轉(zhuǎn)移到含有一薄層對照培養(yǎng)基(以此保持一定的濕度，確保在觀察根毛的過程中，根毛不會干枯萎縮)的載玻片上，保持根毛在培養(yǎng)皿中的生長狀態(tài)。將載玻片置于BH2Olympus顯微鏡的載物臺上，于10倍物鏡下觀察根毛，統(tǒng)計距離根尖1 cm這段根長上分叉根毛和總根毛的數(shù)量。分叉根毛是從膨大的根毛基部產(chǎn)生多個頂端或是正在伸長的根毛停止伸長而從側面產(chǎn)生一個新的頂端的根毛。分叉根毛的比率=分叉根毛數(shù)/總根毛數(shù)。

1.3.2根毛長度幼苗處理2 d后，將生長有幼苗的培養(yǎng)皿置于體式鏡(MZFLIII，Leica Microsystem，Wetzlar，Germany)載物臺上，對距根尖1 cm處的根部拍照，利用軟件Motic Images Plus 2.0 (China Group CO., LTD.)分析根毛的長度。

1.4　數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0分析軟件進行統(tǒng)計分析,并進行 LSD和Duncan檢驗(P<0.05)。

2　結果與分析

2.1　ROS在NH4NO3誘導根毛分叉中的作用

如圖1所示，NH4NO3在誘導擬南芥分叉根毛形成時存在著劑量效應，濃度越高，分叉根毛產(chǎn)生得越多。處理2 d后，NH4NO3的濃度從1～50 mmol·L-1都能顯著地增加分叉根毛的數(shù)量(圖1，A);當NH4NO3的濃度達到20和50 mmol·L-1時，分叉根毛的數(shù)量也達到最大。由于2種濃度的NH4NO3誘導根毛分叉的效果相似，后續(xù)實驗就選擇20 mmol·L-1作為處理濃度。此外，各濃度NH4NO3處理均顯著抑制了根毛的長度，且高濃度(20和50 mmol·L-1) NH4NO3處理抑制根毛伸長的效果更明顯(圖1，B)。

圖中柱上不同的字母表示處理間差異達到0.05顯著性水平，下同圖1　不同濃度NH4NO3對擬南芥根毛發(fā)育的影響Different normal letters indicate significance difference among treatments at 0.05 level. The same as in the following figuresFig.1　The effects of different concentrations of NH4NO3 on root hair development in Arabidopsis seedling

ROS不僅是調(diào)控根毛發(fā)育的一個關鍵因子，而且ROS信號也參與營養(yǎng)元素對根毛發(fā)育的調(diào)控[25]，本研究進一步探究ROS是否參與NH4NO3誘導的根毛分叉。外源進行ROS處理，且ROS以OH·的形式提供，當用外源ROS處理時，由NH4NO3誘導的分叉根毛數(shù)量大大減少，這說明ROS產(chǎn)生異常是NH4NO3誘導根毛分叉的主要原因(圖2，A)。

根據(jù)上述結果，猜測NH4NO3誘導分叉根毛的形成可能是由于高濃度銨處理早期ROS產(chǎn)生減少(圖2，A)，外源補充ROS抑制了高濃度銨誘導的根毛分叉，而隨著高濃度銨處理，后期ROS的產(chǎn)生又有所恢復，進而形成一個新的起點，造成根毛分叉。如果能夠一直抑制ROS的產(chǎn)生，雖然根毛產(chǎn)生的數(shù)量會大大減少，但是這些產(chǎn)生的根毛可能不會分叉。DPI是NADPH 氧化酶的抑制劑，可以抑制ROS的產(chǎn)生[24]。圖2，A 還顯示，NH4NO3和DPI共同處理后，根毛的數(shù)量很少(圖中未顯示出，但是分叉根毛是將分叉的根毛除以總根毛數(shù)，所以原始數(shù)據(jù)可以看出)，但在產(chǎn)生的根毛中幾乎沒有根毛分叉出現(xiàn)。另外，NH4NO3與ROS以及NH4NO3和DPI共同處理均顯著抑制了根毛的伸長(圖2，B)。上述實驗進一步說明ROS的產(chǎn)生及分布決定了根毛頂端伸長的方向，高銨誘導根毛分叉的重要原因是改變了根毛活性氧的產(chǎn)生和分布。

2.2　NH4NO3誘導分叉根毛形成中生長素和乙烯之間的相互作用

2.2.1生長素和乙烯抑制NH4NO3誘導的根毛分叉植物激素生長素和乙烯參與調(diào)控根毛發(fā)育的各個階段。為了研究生長素和乙烯是否參與NH4NO3誘導根毛分叉的過程，將生長4 d的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)入含有NH4NO3及不同濃度吲哚乙酸(IAA)和乙烯(ACC)的培養(yǎng)基上。由圖3，A可知，在IAA濃度為0.1和0.5 μmol·L-1時，由于NH4NO3的存在而導致的分叉根毛數(shù)量大量減少，分別僅為對照的1/6和1/30。同時，外源ACC處理顯著抑制了由NH4NO3誘導而產(chǎn)生的分叉根毛數(shù)，且隨著ACC濃度從0.04 μmol·L-1增加到1 μmol·L-1，分叉根毛產(chǎn)生的比率減少到原來對照的1/4～1/20(圖3，B)。上述結果表明生長素和乙烯能夠抑制由于NH4NO3的存在而導致的根毛分叉。

2.2.2生長素和乙烯相互作用抑制NH4NO3誘導根毛的分叉在根毛發(fā)育過程中還存在著生長素和乙烯的相互作用。利用生長素不敏感型突變體和乙烯不敏感型突變體進一步研究兩者在NH4NO3誘導根毛分叉中的相互作用。

由圖4，A可知，乙烯不敏感型突變體etr1-3及生長素不敏感型突變體axr1-3和aux1-7在高濃度NH4NO3存在時，與野生型相似也產(chǎn)生大量的分叉根毛。外源1 μmol·L-1ACC和0.1 μmol·L-1

圖2　ROS和DPI在NH4NO3誘導擬南芥根毛分叉中的作用Fig.2　Effects of ROS and DPI on NH4NO3-induced root hair formation in Arabidopsis seedlings

圖3　生長素(IAA)和乙烯(ACC)抑制NH4NO3誘導的擬南芥根毛分叉Fig.3　Auxin(IAA)and ethylene(ACC)inhibited NH4NO3-induced branched root hair formation in Arabidopsis seedlings

圖4　ACC、IAA和NAA在NH4NO3誘導的擬南芥分叉根毛形成中的作用Fig.4　Effects of ACC, IAA and NAA on NH4NO3-induced branched root hair formation in etr1-3, aux1-7 and axr1-3 seedlings

IAA處理各種突變體時，對于etr1-3來說，ACC的處理使分叉根毛減少了25.2%，而IAA的處理則使分叉根毛幾乎不存在，分叉根毛的比率約是對照的1/20。這說明在缺乏乙烯信號傳遞時生長素能夠抑制由于NH4NO3的存在而導致的根毛分叉，ACC之所以能部分抑制etr1-3分叉根毛的產(chǎn)生是因為etr1-3并非完全對ACC不敏感。對于axr1-3來說，IAA的處理使分叉根毛減少了24.6%，ACC處理則導致分叉根毛的比率僅為對照的1/20。這說明在缺乏生長素信號傳遞時，乙烯同樣也能抑制分叉根毛的產(chǎn)生。aux1-7不僅抗生長素而且也抗乙烯[26]，外源IAA和ACC處理aux1-7均不能抑制由于NH4NO3的存在而導致的根毛分叉現(xiàn)象(圖4，A)。

圖5　ACC和IAA在NH4NO3誘導的擬南芥突變體etr1-1分叉根毛形成中的作用Fig.5　Effects of ACC and IAA on NH4NO3-induced branched root hair formation in etr1-1 seedlings

突變體aux1-7是缺乏生長素運輸載體的突變體，而NAA主要通過擴散進入植物體[27]，如果生長素在缺乏乙烯信號傳遞時能夠抑制由于NH4NO3的存在而導致的根毛分叉，外源NAA處理aux1-7應該能夠抑制分叉根毛的產(chǎn)生。由圖4，B可知，NAA處理抑制了NH4NO3誘導的aux1-7根毛的分叉。以上結果表明，生長素在缺乏乙烯信號傳遞時能夠抑制分叉根毛的產(chǎn)生，而乙烯在缺乏生長素信號傳遞時也同樣能夠抑制根毛的分叉，生長素和乙烯2種激素在缺乏對方時，其抑制根毛分叉的作用可以通過另一種激素所起的補充作用來實現(xiàn)。

同時，在抑制NH4NO3誘導的根毛分叉時，生長素和乙烯之間是否還存在著相互依賴關系呢？利用突變體etr1-1來進一步說明這個問題。與NH4NO3處理相比，ACC處理沒有顯著影響etr1-1分叉根毛的比率，0.1 μmol·L-1IAA處理使etr1-1分叉根毛的比率降低了約50%(圖5)，而0.1 μmol·L-1IAA處理幾乎可以完全抑制WT根毛的分叉(圖4，A)，說明缺乏乙烯信號時，生長素抑制根毛分叉的作用有所減弱。另外，將IAA的濃度增加為0.5 μmol·L-1，則etr1-1產(chǎn)生分叉根毛的比率可以降低到1.2%，分叉根毛的產(chǎn)生基本解除(圖5)。表明生長素能夠抑制因NH4NO3存在而導致的根毛分叉現(xiàn)象，但在缺乏乙烯信號傳遞時，需要更高濃度的生長素才能充分發(fā)揮其抑制根毛分叉的作用。

3　討　論

3.1　ROS參與NH4NO3誘導的根毛分叉

不同形態(tài)和濃度的氮素對擬南芥根毛的發(fā)育有不同的作用。 Vatter等[28]研究發(fā)現(xiàn)局部供應銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，隨著濃度的增加，根毛的長度逐漸降低，且硝態(tài)氮的作用表現(xiàn)得更加明顯。前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著氮素濃度的增加，不管是銨態(tài)氮還是硝態(tài)氮，擬南芥根毛伸長受阻，高濃度銨態(tài)氮誘導根毛大量分叉，而高濃度的硝態(tài)氮則不能引起根毛的分叉[23]。本試驗結果再次表明隨著外界NH4NO3濃度的增高，根毛長度呈現(xiàn)遞減趨勢，而分叉根毛產(chǎn)生的數(shù)量則呈現(xiàn)遞增趨勢。

ROS的產(chǎn)生及分布控制著根毛的正常發(fā)育[25]。Carol等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體scn1 根毛中ROS的產(chǎn)生不是集中于根毛的頂端，而是分布于整個根毛的表面，根毛分叉嚴重，說明ROS的正確分布對根毛的頂端伸長發(fā)揮重要的作用。PFT1通過調(diào)控過氧化物酶的表達而參與調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生，突變體pft1 的根毛起始和伸長均受阻，表明ROS的產(chǎn)生和分布對根毛發(fā)育至關重要[30]。本研究結果顯示，外源ROS(以OH·形式提供)與高濃度NH4NO3共同處理擬南芥幼苗可以一定程度上抑制根毛分叉，表明ROS參與調(diào)控了NH4NO3誘導的根毛分叉。Carol等[29]研究還顯示雙突變體scn1rhd2 產(chǎn)生的根毛數(shù)量很少，但是分叉根毛的形成大大減少，再次說明ROS是調(diào)控根毛發(fā)育的關鍵因子。在本試驗中，外源DPI與NH4NO3共同處理使根毛產(chǎn)生數(shù)量減少，但是所產(chǎn)生的根毛中幾乎沒有分叉根毛，進一步證明ROS的產(chǎn)生及正確分布在NH4NO3調(diào)控根毛發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

3.2　生長素和乙烯相互作用抑制分叉根毛的產(chǎn)生

生長素和乙烯是調(diào)控根毛發(fā)育的關鍵因子。Pitts等[7]發(fā)現(xiàn)與生長素和乙烯信號傳遞相關的突變體嚴重影響根毛的發(fā)育，外源2, 4-D和ACC處理野生型擬南芥和突變體axr1、etr1后，根毛的長度與未處理的相比明顯增長。這些結果表明生長素和乙烯能夠促進根毛的頂端伸長。Ringli等[31]篩選到8種der(deformed root hairs)突變體，有些影響根毛的起始，有些影響根毛的頂端伸長,這些突變體從不同的發(fā)育階段影響根毛生長。外源生長素和乙烯的處理抑制其中一些突變體根毛發(fā)育的異常現(xiàn)象說明兩者影響了根毛發(fā)育的整個過程[31]。本研究結果顯示，外源生長素和乙烯處理生長于高濃度NH4NO3條件下的擬南芥幼苗，可以基本解除由于NH4NO3存在而引起的根毛分叉，表明生長素和乙烯參與了NH4NO3誘導的根毛發(fā)育。

Takahashi等[32]報道外源生長素和乙烯相互作用調(diào)控萵苣根毛的發(fā)生。生長素和乙烯均通過調(diào)控微管排列而誘導萵苣根毛的產(chǎn)生，乙烯是通過生長素的作用而實現(xiàn)的。Rahman等[33]研究發(fā)現(xiàn)在根毛發(fā)育的不同階段生長素和乙烯以不同的相互作用方式調(diào)控根毛的發(fā)育。在根毛發(fā)育的早期，缺乏乙烯信號傳遞時(如對于突變體ein2-1)內(nèi)源生長素可以發(fā)揮彌補缺乏乙烯的作用；而在根毛頂端伸長階段，生長素和乙烯共同調(diào)控這個階段，當缺乏乙烯信號傳遞時，根毛的頂端伸長過程需要更高濃度的生長素才能完成。本研究結果與以上結果相似，生長素和乙烯都能抑制由于NH4NO3的存在而導致的根毛分叉現(xiàn)象，缺乏生長素信號傳遞時，乙烯可以發(fā)揮補充作用，而當缺乏乙烯信號傳遞時，生長素也可以發(fā)揮補充作用，只是需要更高濃度的生長素才能充分發(fā)揮其抑制根毛分叉的作用。

綜上所述，本研究結果表明，ROS參與了NH4NO3誘導的擬南芥根毛分叉，生長素和乙烯相互作用抑制NH4NO3誘導的分叉根毛形成。

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