廖冰楠,陸俊杏,黃興琳,管　麗,白輝揚(yáng),張　濤

(重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331)

鳳丹牡丹(Paeoniaostii)隸屬芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan DC.)，是一種聞名世界的園藝和藥用植物。牡丹作為世界上最古老的多年生開花植物之一，在中國(guó)有超過3 000年而在歐洲也至少有500年的歷史。它除了具有獨(dú)特的觀賞價(jià)值外，還是不可多得的傳統(tǒng)藥材，更是一種新興且經(jīng)濟(jì)效益較高的木本油料作物[1-3]。它不僅耐寒抗旱、適應(yīng)力強(qiáng)，而且株型高大、結(jié)實(shí)率高，主要分布于四川、甘肅、陜西秦嶺、河南洛陽(yáng)、山東菏澤、安徽銅陵等地[4-6]。牡丹籽油富含人體不能自主合成的必需脂肪酸α-亞麻酸，它屬ω-3 系列不飽和脂肪酸，是 DHA 和 EPA 的前體，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防神經(jīng)和心腦血管疾病、降低血脂和抑制衰老等重要作用[7-9]。自 2011 年第 9 號(hào)衛(wèi)生部公告公布以來(lái)，新資源食品牡丹籽油的開發(fā)利用引起各界人士的廣泛關(guān)注，脂肪酸的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)[10]。

硬脂酰-ACP 脫氫酶(stearoyl-ACP desaturase，SAD)是高等植物脂肪酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化硬脂酰ACP 在 C9 與 C10 之間引入一個(gè)雙鍵形成油酰-ACP，在飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸的過程中起重要作用。從前人的研究中發(fā)現(xiàn)，SAD基因在向日葵[11]、菜豆[12]、芍藥[13]、蓖麻[14]、大豆[15]和煙草[16]等植物中都已成功克隆，并有了較深入的功能研究。在木本植物油桐[17]、山茶花[18]、可可樹[19]、澳洲堅(jiān)果[20]和川桑[21]中也都已進(jìn)行了SAD基因克隆分析和初步功能驗(yàn)證。對(duì)于鳳丹牡丹，目前在分子水平上的研究甚少，鳳丹牡丹SAD基因的研究未見報(bào)道。在脂肪酸組成成分和含量方面已有部分研究[5]，而鳳丹牡丹籽中不飽和脂肪酸高含量以及相關(guān)脫氫酶基因的表達(dá)與不飽和脂肪酸積累的相互聯(lián)系至今少有相關(guān)報(bào)道。

本研究對(duì)鳳丹牡丹硬脂酰-ACP 脫氫酶PoSAD基因進(jìn)行 RACE 克隆以及生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì)不同組織中PoSAD基因進(jìn)行表達(dá)分析，分析多不飽和脂肪酸的積累模式，為PoSAD基因在不飽和脂肪酸生物合成過程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)，為PoSAD基因的鑒定以及蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能驗(yàn)證提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材　料

鳳丹牡丹(Paeoniaostii)種植于重慶師范大學(xué)牡丹園試驗(yàn)基地。試驗(yàn)于 2016 年 3～6 月在重慶師范大學(xué)細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。分別取牡丹根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊和不同時(shí)期的種子，經(jīng)液氮速凍后 -80 ℃保存，備用。

工程菌EscherichiacoliDH5α為細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。PremixTaq酶、T4DNA 連接酶、DL2000 Marker、T/A 克隆載體 pGEM-T、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于 TaKaRa 公司。EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒(DNase I)購(gòu)于北京博邁德公司。熒光定量試劑盒購(gòu)于成都百樂公司。

1.2　方　法

1.2.1引物設(shè)計(jì)和基因克隆從 NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得 1 條牡丹 EST 序列信息，GenBank 登錄號(hào)為 JI454401.1。分別設(shè)計(jì) 5′ 端和 3′ 端 RACE 引物，將獲得的末端序列通過電子拼接得全長(zhǎng) cDNA 序列。采用軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)基因特異性引物，5′ 端和 3′ 端 RACE 引物各2條，用于 RACE 第一次擴(kuò)增和巢式擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)引物：上游引物：PsSAD-GSP1、PsSAD-GSP2；下游引物：PsSAD-NGSP1、PsSAD-NGSP2(表1)。按照試劑盒使用說(shuō)明提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，利用設(shè)計(jì)的引物，以上述 cDNA 為模板，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收、連接克隆載體 pGEM-T，然后轉(zhuǎn)化 DH5α，進(jìn)行抗性篩選，PCR 鑒定后挑選單克隆送測(cè)序。引物及測(cè)序均由英濰捷基有限公司完成。

表1　PCR引物

1.2.2PoSAD基因cDNA序列生物信息學(xué)分析用 Vector NTI Advance 11 軟件來(lái)進(jìn)行序列比對(duì)、查找開放閱讀框和翻譯，SignalP4.1 server 分析信號(hào)肽，TMHMM Server v.2.0 分析跨膜區(qū)等。利用 Phyre2 在線分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。利用 MEGA 7.0 軟件采用鄰接法對(duì)同源蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3PoSAD基因組織特異性表達(dá)分析根據(jù)已克隆的鳳丹PoSAD的 cDNA 分析結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光定量引物，分別以根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊和不同時(shí)期種子的 cDNA 為模板，以PUF1639為內(nèi)參基因[22]，反應(yīng)引物：PUF1639 Forward、PUF1639 Reverse、PoSADForward、PoSADReverse(表1)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)PoSAD在不同器官中的表達(dá)水平。RT-PCR 依照 SYBR?Premix Ex TaqTM II(TaKaRa公司)使用說(shuō)明，在儀器 CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad公司)上進(jìn)行。處理 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用 Excel 進(jìn)行平均數(shù)統(tǒng)計(jì)，以 SPASS 軟件進(jìn)行方差分析，繪制 RT-PCR 分析圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　PoSAD 基因全長(zhǎng) cDNA 的克隆

通過 RACE 法，以鳳丹牡丹葉片 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、TA 克隆和測(cè)序分析，獲得 5′ 末端序列長(zhǎng)度約 1 200 bp，獲得 3′ 末端序列長(zhǎng)度約 900 bp(圖1)。經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致。測(cè)序獲得兩末端片段后通過 NCBI 上 Blast 比對(duì)分析，確定了起始密碼子 ATG 的位置，即PoSAD基因的 5′ 端，存在明顯的 poly(A)加尾現(xiàn)象。然后進(jìn)行電子拼接，成功從鳳丹牡丹中克隆到全長(zhǎng)PoSAD(GenBank 登錄號(hào)為 KY038819)，經(jīng) Blastn 序列比對(duì)表明，克隆的PoSAD與蓖麻(Ricinuscommunis)SAD(NM-001323709.1)具有82% 相似性。 Vector NTI Advance 11 軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)序列共 1 559 bp，其中 5′ 非翻譯區(qū)123 bp，3′端非翻譯區(qū)共 172 bp，包含 1 197 bp完整開放閱讀框。

方框標(biāo)出起始密碼子ATG；星號(hào)標(biāo)出終止密碼子TGA圖1　PoSAD 核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列圖譜The initiation codon ATG is marked with box; The stop codon TGA is marked with asteriskFig.1　The sequence map of PoSAD nucleotide and putative amino acid

圖2　PoSAD 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2　Prediction of PoSAD conserved domains of P. ostii

圖3　鳳丹牡丹 SAD 與其他植物 SAD 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree analysis of SAD of P. ostii and SADs of other plants

2.2　PoSAD 基因 cDNA 序列的生物信息學(xué)分析

SignaIP server 預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，TMHMM Server v.2.0 分析該蛋白無(wú)跨膜域。亞細(xì)胞定位軟件 WoLF PSORT 預(yù)測(cè) PoSAD 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮功能。NetPhos2.0 預(yù)測(cè)它具有 25 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，主要包括 14 個(gè)絲氨酸(Serine)、8 個(gè)蘇氨酸(Threonine)和 3 個(gè)酪氨酸(Tyrosine)。由此推測(cè) PoSAD 蛋白活性可能與其磷酸化調(diào)控有一定聯(lián)系。利用 NCBI 在線分析工具 CDD 分析保守結(jié)構(gòu)域(CD)，結(jié)果表明，PoSAD 屬于 Ferritin-like 蛋白超家族(圖2)。

2.3　PoSAD 蛋白質(zhì)的進(jìn)化分析

不同小寫字母代表不同組織部位的差異顯著性(P<0.05)圖4　鳳丹牡丹不同組織的 RT-PCR 分析Different normal letters show significant differences in different tissues(P<0.05)Fig.4　RT-PCR analysis of PoSAD expression in different tissues of P. ostii

從 NCBI 中查找到 11 種植物的 SAD 蛋白序列，采用 MEGA7.0 鄰接法與鳳丹牡丹 SAD 蛋白序列對(duì)比并建立無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹。鳳丹牡丹與蓖麻(Ricinuscommunis)、煙草(Nicotianatabacum)、向日葵(Helianthusannuus)等 11 個(gè)高等植物的 SAD 蛋白序列比對(duì)顯示，11 個(gè)植物SAD 氨基酸序列被聚為兩大類，澳洲堅(jiān)果、山茶花與煙草聚為一支；鳳丹牡丹與蓖麻處于同一分支，其親緣關(guān)系最近，其序列一致性為 81.0% ；與可可樹、油桐、川桑等其他物種的 SAD 蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)，推測(cè)鳳丹牡丹SAD基因的功能可能與蓖麻SAD基因功能相似。

2.4　PoSAD 基因組織特異性表達(dá)分析

不同小寫字母代表種子不同時(shí)期的差異顯著性(P<0.05)圖5　鳳丹牡丹種子不同時(shí)期的 RT-PCR 分析Different normal letters show significant differences in different growth stages(P<0.05)Fig.5　RT-PCR analysis of PoSAD expression in different growth stages of P. ostii seeds

實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，從其組織特異性表達(dá)來(lái)看，PoSAD在不同器官中均有表達(dá)，在花瓣中的表達(dá)量最高，約為根的 8 倍，雌蕊和雄蕊表達(dá)次之，根中表達(dá)最低(圖4)。其中，花瓣的表達(dá)量與根、莖、葉、雄蕊的表達(dá)量有顯著性差異；表達(dá)量次之的雌蕊與根、莖、葉之間有顯著性差異；低表達(dá)量的根與高表達(dá)量的花瓣、雌蕊和雄蕊之間也有顯著性差異。在不同發(fā)育時(shí)期的種子中，表達(dá)量隨著種子成熟逐漸呈上調(diào)趨勢(shì)，其中成熟期種子 60 d 的表達(dá)量最高，80 d 次之，而幼種 10 d 表達(dá)最低(圖5)。60 d 和 10 d 的表達(dá)量與另外4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均有顯著性差異。

3　討　論

本研究以鳳丹牡丹為研究對(duì)象，在已知牡丹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，采用RACE擴(kuò)增克隆獲得PoSAD全長(zhǎng)cDNA序列，通過同源比較發(fā)現(xiàn)所得目的片段與蓖麻相似性極高。序列分析表明，PoSAD同向日葵、油桐、川桑等 11 種高等植物SAD氨基酸序列相似性高達(dá)70%以上，它們都具有SAD的1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，同屬 Ferritin-like 蛋白超家族，表明該結(jié)構(gòu)域在分析進(jìn)化過程中的穩(wěn)定性較高，這可能與其在生長(zhǎng)代謝中所具有的功能相關(guān)[23]。

氨基酸序列進(jìn)化分析表明，鳳丹牡丹 PoSAD 序列與蓖麻聚為一類，蓖麻同屬油料植物，這說(shuō)明序列相似的基因在進(jìn)化時(shí)相對(duì)保守，在植物的脂肪酸合成中發(fā)揮相似的功能[24]。研究跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析得知，PoSAD 蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，可能定位于葉綠體中發(fā)揮功能，預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，這將對(duì)研究 PoSAD 蛋白的相關(guān)功能提供參考。

研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜硬脂酰-ACP 脫氫酶基因PoSAD在根、莖、葉、花蕾、花瓣、角果皮、雄蕊、柱頭及種子中均能表達(dá)，且在花中的表達(dá)量最高,其次是葉片[25]。本研究中，雖然PoSAD在鳳丹牡丹的組織器官中均能檢測(cè)到表達(dá)，但其組織器官存在顯著性差異，PoSAD在不同組織中表達(dá)結(jié)果顯示，鳳丹PoSAD在花瓣中表達(dá)量最高，雌蕊、雄蕊次之，根中表達(dá)最低。此現(xiàn)象表明該基因具有轉(zhuǎn)錄活性。在不同發(fā)育時(shí)期的種子中都有表達(dá)，授粉后 60 d 的表達(dá)量最高，表明授粉后種子中PoSAD迅速積累并發(fā)揮了脫氫酶的作用；隨著種子逐漸成熟PoSAD表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，可能PoSAD的活性與底物硬脂酸含量的變化相關(guān)，說(shuō)明本研究克隆得到的PoSAD可能在牡丹種子脂肪酸合成途徑中發(fā)揮重要作用[26]。

研究PoSAD在鳳丹牡丹中的組織特異性表達(dá)，分析多不飽和脂肪酸的積累模式，進(jìn)而為研究脂肪酸生物合成的分子機(jī)理及代謝途徑，利用基因工程手段來(lái)調(diào)控脂肪酸含量提供了理論依據(jù)，為深入探索該蛋白表達(dá)及其功能奠定基礎(chǔ)。

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