萬永青，毛銘銖，萬東莉，柳金華，王光霞，李國婧，王瑞剛*

(1 內蒙古農業(yè)大學 生命科學學院，呼和浩特 010018；2 中國農業(yè)科學院 草原研究所，呼和浩特 010010；3 內蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，呼和浩特 010018；4 農業(yè)部草地生態(tài)與修復治理重點實驗室，呼和浩特 010010)

鹽堿和干旱等非生物脅迫是造成農作物等減產的主要原因之一[1]。內蒙古地區(qū)處干旱半干旱區(qū)域，農業(yè)生產中的干旱、低溫和鹽堿化問題比較突出。中間錦雞兒(Caraganaintermedia)屬于豆科(Fabaceae)錦雞兒屬(Caragana)蝶形花亞科 (Papilionoideae)植物，與小葉錦雞兒、檸條錦雞兒親緣關系較近[2]，統(tǒng)稱為檸條，分布于山西、陜西、寧夏及內蒙古自治區(qū)等省、區(qū)。檸條是典型的旱生植物，生態(tài)適應性極強，被廣泛應用于生態(tài)修復工程。檸條抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐瘠薄，因此對其耐逆境的分子機制研究逐漸成為熱點。對中間錦雞兒和檸條錦雞兒在不同逆境處理條件下的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)基因表達分析的內參基因進行了篩選[3-4]，為研究錦雞兒屬植物的基因功能奠定了重要基礎。在煙草中過量表達中間錦雞兒miR2118能增強植物的耐旱能力，并改變植物正常形態(tài)的建成[5]。在擬南芥中過量表達中間錦雞兒CiNAC3和CiNAC4，增強了植物對鹽脅迫的耐受能力[6]。中間錦雞兒CiDHN1的表達受冷、脫水和NaCl等非生物脅迫的誘導，在擬南芥過量表達CiDHN1后，其中表達量最強的株系表現(xiàn)出對NaCl處理敏感的表型[7]。

WRKY轉錄因子是植物最大的轉錄調節(jié)子家族之一，是信號網絡不可缺少的部分，調節(jié)許多植物生物學進程，例如防御反應、衰老和非生物脅迫響應等[8]。WRKY轉錄因子最典型的特征就是其DNA結合結構域，一般由約60個氨基酸組成，靠近N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK，在C-端含有一個非典型的鋅指結構(CX4-5CX22-23HXH或者 CX7CX23HXC)[8]。根據WRKY結構域的數目和鋅指的結構，WRKY轉錄因子可分為三大類：第Ⅰ類，含有2個WRKY結構域，鋅指結構類型為C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型；第Ⅱ類，含有1個WRKY結構域，鋅指結構為C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型，第Ⅱ類又可以分為a、b、c、d和e 5個亞族；第Ⅲ類，含有1個WRKY結構域，鋅指結構為C2HC(CX7CX23HXC)型[9]。

WRKY轉錄因子在植物體內的表達受各種環(huán)境因子誘導，包括各種非生物和生物脅迫[10-14]。在擬南芥中表達對干旱響應的小麥TaWRKY1和TaWRKY33增強了擬南芥對干旱和熱的抵抗能力[15]。CmWRKY1通過調節(jié)ABA相關基因而增強菊花的耐旱能力[16]。AtWRKY53通過調節(jié)氣孔運動而負調節(jié)擬南芥對干旱的耐受能力[17]。擬南芥功能獲得型突變體adt中通過激活表達AtWRKY57而賦予了擬南芥抗旱的能力[18]。擬南芥中表達野生大豆的WRKY20增強了植物的耐旱能力[19]。水稻的2個等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在ABA信號途徑和對鹽的適應上的作用不同，OsWRKY45-2過表達株系增強了對ABA的敏感性、減弱了對鹽的耐受能力，而OsWRKY45-1過表達株系對ABA的敏感性減弱，同時對鹽的耐受性與對照相比無明顯區(qū)別[20]。此外，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2均負調節(jié)水稻對冷和干旱脅迫的響應[20]。過量表達AtWRKY25和AtWRKY39均提高了擬南芥對熱脅迫的耐受能力[21-22]。AtWRKY6和AtWRKY42通過調節(jié)PHO1的表達而參與擬南芥對低磷的響應[23]。過量表達OsWRKY74增強了水稻對磷饑餓的耐受性[24]。過量表達OsWRKY89增強了水稻對紫外輻射的耐受能力[25]。AtWRKY70和AtWRKY54通過調節(jié)氣孔開度而參與擬南芥對滲透脅迫的響應[26]。

本研究在中間錦雞兒干旱轉錄組庫中，篩選、克隆到了1個CiWRKY75基因，進行了生物信息學分析和亞細胞定位研究，并在擬南芥中過量表達CiWRKY75對其在植物抵抗鹽和ABA處理中的功能進行探討，以期為中間錦雞兒耐逆境脅迫的分子機制研究提供理論基礎和實驗支持。

1　材料和方法

1.1　植物材料、菌體和載體

中間錦雞兒的種子于2014年采自內蒙古烏蘭察布市四子王旗(111.69°E, 41.44°N)。擬南芥Columbia-0(Col-0)野生型種子由實驗室保存。大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌GV3101均為本實驗室保藏菌種。連接載體pEASY-Blunt Simple購自北京全式金生物技術有限公司；表達載體pCambia1302和pCanG-HA由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所謝旗研究員惠贈。

1.2　方　法

1.2.1中間錦雞兒培養(yǎng)及脅迫處理選取均一飽滿的中間錦雞兒種子播種于裝有蛭石和營養(yǎng)土(2∶1)的培養(yǎng)缽中，置于溫室，溫度23～25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。生長25 d后選取長勢一致的中間錦雞兒幼苗用作鹽和ABA處理。處理前將中間錦雞兒幼苗小心地從培養(yǎng)缽中取出，洗凈根上的土和蛭石，并浸入水中生長2 d后，分別浸于300 mmol/L NaCl溶液和100 μmol/L ABA溶液中[27]，在處理的0、1、3、6、9、12、24和48 h取樣。每個處理時間點取3株植物混合作為后續(xù)檢測的樣品，每個處理重復3次。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成利用Trizol試劑提取中間錦雞兒地上組織總RNA，方法詳見文獻[6]。cDNA的合成使用M-MLV反轉錄酶(TaKaRa公司)，具體步驟按產品說明書進行。

1.2.3基因全長克隆及進化樹構建依據中間錦雞兒WRKY75基因序列，利用Primer Premier 5.0設計基因全長擴增引物CiWRKY75-HA-F/CiWRKY75-HA-R (表1)，并以中間錦雞兒cDNA為模板，通過PCR技術對目的基因進行擴增，用膠回收試劑盒(百泰克)回收目的PCR產物，并與pEASY-Blunt Simple載體(全式金)連接，轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選挑取單菌落利用M13引物進行PCR驗證，將陽性克隆進行測序驗證。利用DNAMAN7分析CiWRKY75的ORF序列及其推導的氨基酸序列，采用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對CiWRKY75的保守結構域進行預測。利用NCBI blastp對序列進行比對分析，選取相關序列，運用MEGA6軟件進行align，采用鄰近法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值設為1 000次。

1.2.4CiWRKY75與GFP融合表達載體構建以中間錦雞兒的cDNA為模板，利用引物 CiWRKY75-GFP-F/CiWRKY75-GFP-R(表1)對目的基因CiWRKY75進行擴增，與克隆載體pEASY-Blunt Simple連接后，將陽性克隆進行測序驗證。測序驗證正確后，利用限制性內切酶NcoⅠ/SpeⅠ(Thermo Fisher Scientific)將目的基因切下，通過T4連接酶(Thermo Fisher Scientific)將目的基因和同樣經過NcoⅠ/SpeⅠ酶切過的pCambia1302載體(含有35S啟動子)相連接，獲得CiWRKY75與GFP融合表達載體35S∷CiWRKY75-GFP。

1.2.5亞細胞定位將重組質粒35S∷CiWRKY75-GFP轉入到擬南芥原生質體，擬南芥原生質體制備及轉化方法參考Yoo等的方法[28]。利用熒光顯微鏡(Zeiss)對轉化重組質粒的原生質體進行GFP熒光信號觀察。

1.2.6不同脅迫下CiWRKY75基因表達分析利用羅氏LightCycler 480 Real-Time PCR System，TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR檢測。PCR反應體系為：SYBR Ⅱ 10 μL，正、反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)，cDNA模板(反轉錄得到的cDNA原液稀釋16倍)5 μL，DEPC水4.2 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。

采用2-ΔΔCT法對基因表達量進行分析。以中間錦雞兒的CiEF1α為內參基因。每個樣品3個技術重復，每個實驗進行3次獨立的生物學重復。引物序列見表1。

1.2.7CiWRKY75過量表達載體構建及擬南芥遺傳轉化利用限制性內切酶SalⅠ/SpeⅠ(Thermo Fisher Scientific)將1.2.3中測序驗證的陽性克隆質粒中的目的基因片段切下，并通過T4連接酶將目的基因與經過相同酶切過的pCanG-HA表達載體(含有35S啟動子)相連接，獲得重組表達載體35S∷CiWRKY75。利用電轉化法將重組表達載體導入到農桿菌GV3101中。采用浸花法[29]轉化野生型擬南芥。采用卡那霉素抗性篩選法對轉基因純合體植株進行篩選。篩選獲得T3代純合體植株后，利用基因特異性引物CiWRKY75-F/CiWRKY75-R，通過qRT-PCR對CiWRKY75在轉基因擬南芥中的表達量進行檢測。以擬南芥AtEF1α基因作為內參(表1)，采用2-ΔΔCT法對基因表達量進行分析。

表1　PCR引物

1.2.8擬南芥脅迫處理(1)萌發(fā)率檢測：將轉基因和野生型擬南芥種子用酒精滅菌后播種于1/2 MS、分別含有200 mmol/L NaCl或2 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，4 ℃黑暗春化3 d后置于溫室培養(yǎng)，并進行萌發(fā)率統(tǒng)計，每天統(tǒng)計1次萌發(fā)率。每處理3個重復，共進行3次獨立的生物學重復實驗。

(2)鹽脅迫處理：將轉基因和野生型擬南芥種子用酒精滅菌后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃黑暗春化3 d后置于溫室培養(yǎng)。待長出2片真葉后，移至浸透營養(yǎng)液的蛭石與營養(yǎng)土為2∶1的混合土中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，澆200 mmol/L NaCl溶液進行耐鹽脅迫處理，共澆3次(每次間隔4～5 d)。培養(yǎng)溫度23～25 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。每個處理進行3次獨立的生物學重復實驗。

2　結果與分析

2.1　CiWRKY75基因克隆鑒定

從中間錦雞兒干旱轉錄組數據庫中篩選獲得注釋為CiWRKY75的基因片段1 087 bp，NCBI比對發(fā)現(xiàn)該基因具有完整的開放閱讀框(ORF)。根據該基因ORF序列設計特異性引物，以中間錦雞兒cDNA為模板，對CiWRKY75基因進行特異擴增(圖1)，并對擴增產物進行測序驗證。測序結果顯示克隆得到的CiWRKY75基因ORF序列長為570 bp，編碼189個氨基酸(圖2)。

2.2　CiWRKY75的保守結構域和進化樹分析

采用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對CiWRKY75的保守結構域進行分析。結果(圖2)顯示，CiWRKY75具有一個WRKY基序(WRKYGQK)和一個C2H2型鋅指結構(CX4CX23HXH)。將CiWRKY75氨基酸序列在NCBI進行相似性比對分析，結果顯示CiWRKY75與已經鑒定的豆科植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的WRKY(XP_013447931)和大豆相似性分別達到76%(序列覆蓋率為98%)和73%(序列覆蓋率為100%)；與擬南芥的AtWRKY75和AtWRKY45相似性分別為87%和78%，序列覆蓋率均為48%。

為了進一步分析CiWRKY75與其他物種同源WRKY的進化關系，選取擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆和二穗短柄草等物種的WRKY蛋白，利用MEGA6.0構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，聚類分析結果顯示，中間錦雞兒WRKY75與蒺藜苜蓿WRKY、大豆WRKY75和木豆WRKY75聚到一起，表明其親緣關系比較近。

M. DL2000；1.CiWRKY75 ORF圖1　PCR克隆CiWRKY75Fig.1　The electrophoresis of the cloned CiWRKY75 using PCR

方框表示保守的WRKY結構域，圓圈表示鋅指結構圖2　CiWRKY75的ORF序列及推導的氨基酸序列The box indicates conserved WRKY domain, the circles indicate zinc finger motifsFig.2　The ORF and deduced amino acid sequences of CiWRKY75

進化樹采用鄰近法構建，Bootstrap值設為1 000次圖3　CiWRKY75的系統(tǒng)進化樹The phylogenetic tree is constructed using the neighbor joining method, Bootstrap values based on 1 000 replicationsFig.3　The phylogenetic tree of CiWRKY75

圖4　擬南芥葉肉細胞原生質體中35S∷CiWRKY75-GFP的亞細胞定位Fig.4　The nuclear localization of 35S∷CiWRKY75-GFP in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplast

2.3　CiWRKY75的亞細胞定位研究

為了研究CiWRKY75亞細胞水平定位，將CiWRKY75的cDNA與GFP報告基因相融合構建35S啟動子驅動的重組表達載體35S∷CiWRKY75-GFP，并轉化野生型擬南芥原生質體，培養(yǎng)約16 h后進行GFP熒光信號觀察。結果(圖4)顯示，對照空載體35S∷GFP的熒光信號遍布整個細胞，而35S∷CiWRKY75-GFP的熒光信號只在細胞核觀察到，這與轉錄因子在細胞核表達的規(guī)律相符合。

2.4　CiWRKY75基因對鹽脅迫和ABA處理響應的表達分析

為了研究CiWRKY75對鹽脅迫和ABA處理的響應情況，利用qRT-PCR檢測了高鹽和ABA處理下中間錦雞兒中CiWRKY75基因的表達模式。結果顯示，高鹽脅迫能強烈誘導CiWRKY75基因的表達;在鹽處理1 h時，CiWRKY75基因明顯被誘導表達，是對照的2.7倍;隨著處理時間的延長，CiWRKY75基因的表達量增強，在48 h表達量是對照的215.6倍。在ABA處理下，與對照相比，CiWRKY75基因在1 h被誘導表達，在6 h達到峰值,是對照的2.9倍 (圖5)。表明CiWRKY75基因可能參與了中間錦雞兒對鹽和ABA響應的分子信號途徑。

2.5　過量表達CiWRKY75減弱了擬南芥對鹽脅迫的耐受能力

為了進一步研究CiWRKY75在擬南芥對逆境脅迫響應中的功能，構建了35S啟動子驅動下的CiWRKY75重組表達載體35S∷CiWRKY75，并轉化野生型擬南芥，通過卡那霉素抗性篩選轉基因植物。根據孟德爾遺傳定律，T2代植物中符合3∶1(抗性苗∶非抗性苗)分離規(guī)律的轉基因株系被認為是單拷貝插入，并繼續(xù)用于T3代純合體篩選，最終篩選獲得15個CiWRKY75過量表達擬南芥轉基因純合體株系(CiWRKY-OE1至OE15)。利用qRT-PCR對過表達株系中CiWRKY75的相對表達量進行檢測(圖6)，結果顯示CiWRKY75在15個過表達株系中均有不同程度的表達，后續(xù)實驗選擇過表達株系OE3、OE5和OE6作為研究材料。

為了檢測CiWRKY75過表達轉基因擬南芥對鹽的耐受能力，進行了萌發(fā)率和4周苗齡植物對鹽的耐受力檢測實驗。萌發(fā)率檢測結果顯示(圖7)，在正常的1/2 MS培養(yǎng)基上，野生型(WT)和轉基因擬南芥沒有區(qū)別，在萌發(fā)的第4天萌發(fā)率均達到100%。在含有200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，與WT相比，轉基因擬南芥的萌發(fā)率降低，在萌發(fā)的第10天，WT的萌發(fā)率為80%，OE3、OE5和OE6的萌發(fā)率分別為69.6%、61.4%和65.9%。對4周苗齡的植物澆200 mmol/L NaCl進行鹽脅迫處理，以正常澆水作為對照。實驗結果顯示(圖8)，在正常條件下WT和轉基因植物沒有明顯的區(qū)別；在鹽脅迫條件下，與WT相比，轉基因植物葉子萎蔫發(fā)白，表現(xiàn)出不耐鹽的表型。以上研究表明過量表達CiWRKY75降低了擬南芥對鹽的耐受性。

圖5　qRT-PCR檢測鹽和ABA處理下中間錦雞兒中CiWRKY75的表達模式Fig.5　The expression patterns of CiWRKY75 in C. intermedia under salt and ABA treatments examined by qRT-PCR

圖6　過表達株系中CiWRKY75的表達Fig.6　The expression levels of CiWRKY75 in the CiWRKY75 over-expression lines

圖7　鹽脅迫下野生型擬南芥和CiWRKY75過表達株系的萌發(fā)率檢測Fig.7　The germination rate of wild-type Arabidopsis and CiWRKY75 over-expression lines under salt treatment

圖8　CiWRKY75過表達株系對鹽的耐受能力檢測Fig.8　Salt tolerance examination of CiWRKY75 over-expression lines

圖9　ABA處理下野生型擬南芥及其CiWRKY75過表達株系的萌發(fā)率檢測Fig.9　The germination rate of wild-type Arabidopsis thaliana and CiWRKY75 over-expression lines under ABA treatment

2.6　過量表達CiWRKY75增強了ABA對擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用

將CiWRKY75轉基因擬南芥播種于含有2 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，以正常1/2 MS培養(yǎng)基作為對照，進行ABA抑制的種子萌發(fā)檢測實驗。結果顯示，在正常1/2 MS培養(yǎng)基平板上，野生型擬南芥與轉基因株系OE5和OE6的萌發(fā)率沒有明顯的區(qū)別，在萌發(fā)后的第2天均達到98%以上。在含有2 μmol/L ABA的培養(yǎng)平板上，與WT相比，轉基因株系OE5和OE6的萌發(fā)率明顯被抑制，在萌發(fā)的第5天，WT的萌發(fā)率為25.9%，而OE5和OE6分別為10.3%和9.6%(圖9)。表明ABA對過量表達CiWRKY75擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用增強。

3　討　論

目前，在不同植物中已發(fā)現(xiàn)了大量的WRKY家族成員。例如擬南芥中鑒定了72個WRKY轉錄因子[11]，水稻中103個[12]，葡萄中80個[30]，大豆中182個[31]，蘋果127 個[32]，二穗短柄草86個[33]，木薯85個[34]，蘿卜95個[35]。本課題組對中間錦雞兒的一個WRKY轉錄因子編碼基因CiWRKY2進行克隆和表達分析，基因表達模式檢測表明干旱、鹽堿、高溫、低溫和ABA處理均能誘導其表達，推測CiWRKY2可能參與了中間錦雞兒對逆境脅迫響應的分子信號途徑[36]。此外，楊杞等對檸條錦雞兒一個WRKY轉錄因子CkWRKY1進行了克隆和干旱脅迫下的表達分析[37]。本研究對從中間錦雞兒干旱轉錄組文庫中獲得的一個WRKY轉錄因子編碼基因CiWRKY75，進行了克隆鑒定分析。通過保守結構域分析顯示CiWRKY75包含一個典型的“WRKYGQK”基序和一個C2H2型鋅指結構，屬于第II類WRKY轉錄因子。系統(tǒng)進化樹結果顯示，在擬南芥的WRKY基因家族中AtWRKY75與CiWRKY75的相似度最高。擬南芥中，AtWRKY75是磷饑餓信號途徑的正調控因子，是根發(fā)育的負調控因子[38-39]。但是中間錦雞兒CiWRKY75是否參與磷信號和影響根的發(fā)育有待于進行實驗研究。

基因表達模式檢測結果顯示CiWRKY75對鹽脅迫處理響應強烈，進一步的研究表明過量表達CiWRKY75基因降低了擬南芥對鹽脅迫的耐受能力，在種子萌發(fā)期間過表達轉基因株系與野生型相比在200 mmol/L NaCl培養(yǎng)平板上的萌發(fā)率降低，表明CiWRKY75是植物響應鹽信號途徑的負調控因子。但是CiWRKY75是如何起作用的？通過調節(jié)哪些基因而參與到鹽信號途徑中的？具體的分子機制還不清楚。

根據已有研究，不同的WRKY在植物抵抗鹽等逆境脅迫信號途徑中的作用不同，并且一個WRKY可能參與多種逆境脅迫途徑。例如在擬南芥中過量表達大豆GmWRKY13和GmWRKY54基因后發(fā)現(xiàn)，GmWRKY54過表達轉基因植物提高了對干旱和鹽害的忍耐性，而GmWRKY13過表達轉基因植株則對鹽害和甘露醇脅迫表現(xiàn)出了易感的表型并對ABA的敏感性降低[10]。過量表達MtWRKY76增強蒺藜苜?？购岛湍望}能力[40]。棉花GhWRKY41正調節(jié)干旱和鹽脅迫，在煙草中過表達GhWRKY41增強植物對干旱和鹽的耐受性[41]。煙草中過表達GhWRKY25導致植物對干旱耐受力減弱、對鹽的耐受力增強[42]。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)，CiWRKY75除了對鹽脅迫處理有響應，對ABA處理也有響應。在ABA處理下，CiWRKY75過表達轉基因植物的種子萌發(fā)率明顯低于野生型擬南芥，表明過量表達CiWRKY75增強了ABA對擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用，CiWRKY75正調控ABA抑制的種子萌發(fā)。但在幼苗的生長過程中CiWRKY75是否影響根的伸長，需要進一步的實驗研究。綜合以上研究結果，作為一個轉錄調控因子，CiWRKY75具體是如何通過調控其下游的基因而參與逆境脅迫響應分子途徑的，是我們下一步重點展開的研究內容。

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