王麗霞,李 彬,楊事維,曹金麗,劉相花,張 凱

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

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雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定新鮮懷山藥中直鏈與支鏈淀粉的含量

王麗霞,李 彬,楊事維,曹金麗,劉相花,張 凱

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

以新鮮懷山藥為原料制備山藥粉,通過(guò)石灰水浸泡工藝提取山藥淀粉。以碘為顯色劑,掃描直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘形成復(fù)合物的全波長(zhǎng)吸收光譜。利用不同濃度的直鏈與支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品分別與碘形成復(fù)合物從而得到淀粉含量與吸光度差值之間的線性關(guān)系制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量。根據(jù)雙波長(zhǎng)選擇原理和掃描光圖譜,確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)為560nm,參比波長(zhǎng)為659nm;支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)為600nm,參比波長(zhǎng)532nm。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明直鏈淀粉與支鏈淀粉的測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.27%與0.63%、回收率也分別達(dá)到了96.18%與97.89%,檢出限分別為0.09mg/L與1.58mg/L,再經(jīng)準(zhǔn)確性分析驗(yàn)證了用雙波長(zhǎng)法測(cè)定山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量的檢測(cè)方法具有較為準(zhǔn)確的效果。

山藥,雙波長(zhǎng),直鏈/支鏈淀粉

山藥為薯蕷科植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的塊莖,具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)肺益腎的功效,對(duì)于預(yù)防治療脾虛久泄、慢性腸胃、肺虛咳喘、糖尿病等疾病有重要作用[1]。山藥塊莖中含多糖、淀粉、蛋白質(zhì)、游離氨基酸等[2]。山藥中含大量淀粉,是重要的淀粉來(lái)源,然而當(dāng)前對(duì)于植物淀粉的研究大都數(shù)都集中于馬鈴薯和玉米淀粉上,對(duì)于山藥淀粉卻研究較少。這些都影響了山藥淀粉的應(yīng)用及其深加工的發(fā)展[3-5]。

淀粉是植物世界中儲(chǔ)備碳水化合物的物質(zhì),人類可以利用其中70%～80%的熱量,淀粉通常以1～100μm或者更大直徑的顆粒狀形式存在。淀粉是由脫水葡萄糖通過(guò)α-D-(1-4)糖苷鍵連接而形成的高分子碳水化合物。雖然淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)還沒(méi)有得到闡述,但是已經(jīng)確定了淀粉是由支鏈淀粉與直鏈淀粉兩種異構(gòu)物質(zhì)按照不同比例構(gòu)成的。直鏈淀粉基本上是由脫水葡萄糖通過(guò)α-D-(1-4)糖苷鍵組成的線性聚合物而支鏈淀粉卻是由α-D-(1-4)糖苷鍵連接的分支狀聚合物,在O-6的位置上有周期性的分支[6]。

山藥淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量因山藥品種不同以及種植地區(qū)的不同而有所差異,決定著山藥淀粉的品質(zhì),并影響著山藥淀粉的加工特性與應(yīng)用。所以測(cè)量山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮懷山藥 產(chǎn)自河南溫縣。

直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于Sigma公司;石油醚、無(wú)水乙醇、氫氧化鈣、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀、正丁醇等均為分析純。

DF-101S恒溫水浴鍋 山東甄誠(chéng)嘉德儀器廠;ESJ205-4電子分析天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;UV-2550PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津(中國(guó))儀器公司;DFG801電熱鼓風(fēng)箱 湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;G10S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥淀粉的提取山藥粉的制備工藝:山藥→清洗→去皮→切片→烘干→粉碎→過(guò)篩→山藥粉。將得到的山藥粉用pH8的Ca(OH)2按照固液比1∶7浸泡,浸泡時(shí)間2h并重復(fù)4次;將沉淀用90%乙醇浸泡2h后烘干;利用索氏抽提對(duì)所得到的山藥淀粉進(jìn)行脫脂處理[7]。

1.2.2 直鏈淀粉與支鏈淀粉的分離純化 采用正丁醇反復(fù)結(jié)晶法,稱取10g淀粉,加入到500mL的燒杯中,加入少量無(wú)水乙醇和蒸餾水使樣品濕潤(rùn),再加入0.5mol/L的NaOH 350mL,沸水浴中加熱攪拌20～30min至完全分散,冷卻后離心(4000r/min,20min)去沉淀,再以2mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至中性,加入100mL正丁醇-異戊醇(3∶1體積比)混合液,然后在沸水浴中加熱攪拌至溶液透明后冷卻至室溫,于4℃冰箱中靜置24h后離心(4000r/min,20min),離心后得到的上清液即為粗支鏈淀粉溶液(Ap),得到的沉淀為粗直鏈淀粉(Am)。

支鏈淀粉的純化:上清液中加入20mL正丁醇于沸水浴中加熱攪拌至溶液分散透明后冷卻至室溫。在4℃冰箱中靜置24h后離心(4000r/min,20min)棄去沉淀并重復(fù)以上操作5次。將收集到的上清液按照2倍體積加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀,再以無(wú)水乙醇洗滌沉淀5、6次,所得到的沉淀在45℃的烘箱中干燥即為支鏈淀粉(Ap)樣品。

直鏈淀粉的純化:向粗直鏈淀粉中加入240mL的正丁醇-水(體積比為1∶8)溶液,在沸水浴中加熱攪拌使其溶解至透明,冷卻后于4℃冰箱中靜置24h,取出后離心(4000r/min,20min)得到的沉淀,重復(fù)以上操作5次后將收集到的沉淀用無(wú)水乙醇洗滌5～6次,將樣品于45℃烘箱中干燥即得到直鏈淀粉(Am)樣品。

1.2.3 淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的配制 分別稱取0.1000g支鏈淀粉和直鏈淀粉置于100mL的燒杯中,加入1mol/L的KOH溶液10mL,于80℃水浴中充分?jǐn)嚢?5min,再用蒸餾水定容至50mL為支鏈淀粉和直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。采用1mol/L的KOH溶液在80℃水浴下分散溶解15min效果最好[8]。

1.2.4 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于100mL燒杯中,加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調(diào)pH至3.0,加0.5mL碘試劑后定容至50mL,靜置30min。

1.2.5 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100mL燒杯中,加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調(diào)pH3.0,加0.5mL碘試劑后定容至50mL,靜置30min。

1.2.6 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測(cè)定 稱取0.1000g的脫脂淀粉,加1mol/L的KOH溶液10mL于100mL燒杯中,將燒杯置于80℃水浴中充分?jǐn)嚢?0min,然后用蒸餾水定容到50mL的容量瓶中,搖勻后靜置。取3mL上清液于100mL燒杯中,以加蒸餾水25mL,以0.1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.0,加0.5mL的碘試劑后轉(zhuǎn)移溶液到50mL的容量瓶中,用蒸餾水加至刻度搖勻后靜置。

1.3 山藥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量的雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蒸餾水為空白,將1.2.4中的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)λ1和參比波長(zhǎng)λ3下相應(yīng)的吸光值A(chǔ)1和A3。以ΔA支=λ1-λ3為縱坐標(biāo),支鏈淀粉質(zhì)量濃度ρ1(mg/L)為橫坐標(biāo)作圖,利用excel繪制雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用同樣方法,將1.2.5中的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)λ2和參比波長(zhǎng)λ4下測(cè)定吸光度A2和A4,以ΔA直=A2-A4為縱坐標(biāo),直鏈淀粉質(zhì)量濃度ρ2(mg/L)為橫坐標(biāo)作圖,繪制雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定,驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性以及可行性。

1.5 準(zhǔn)確性與準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)方法

在已測(cè)得直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的樣品中,添加準(zhǔn)確稱量的自制直鏈和支鏈淀粉純品,按照上述方法測(cè)定直鏈和支鏈淀粉的含量,通過(guò)以下公式計(jì)算回收率和平均回收率。

回收率(%)=混合后測(cè)得量-樣品中直鏈淀粉或支鏈淀粉含量/淀粉純品的加入量×100

準(zhǔn)確度主要是通過(guò)回收率來(lái)反映,分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品直鏈淀粉與支鏈淀粉5份,記錄數(shù)據(jù)后按照上述方法分別測(cè)定其含量,將實(shí)測(cè)值與理論值比較,計(jì)算回收率。并計(jì)算出平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.6 檢出限實(shí)驗(yàn)

式(1)

式(2)

根據(jù)下式求得檢出限:

DL=k·s1

式(3)

式中:DL-檢出限,mg/L或%;s1-濃度或含量測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差,mg/L或%;k-2或3。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)雙波長(zhǎng)比色原理[11],若試樣溶液在兩個(gè)波長(zhǎng)處均有吸收,則兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光值差值與溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度存在線性關(guān)系,從樣品溶液中的直鏈、支鏈淀粉分別與碘生成絡(luò)合物的吸收光譜中,可以確定測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)。

2.1 直鏈、支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)的確定

直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍(lán)色,支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色。用這兩種淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別碘反應(yīng),用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)其分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。選擇波長(zhǎng)需要具備兩個(gè)基本條件,一是同存組分在這兩個(gè)波長(zhǎng)應(yīng)具有相同的吸收值,使其濃度變化不影響到測(cè)定值,二是待定組分在這兩個(gè)波長(zhǎng)的差值應(yīng)足夠大[12]。因此,根據(jù)上述原理和掃描的圖譜,確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)λ2=560nm,參比波長(zhǎng)λ4=659nm。支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)λ1=600nm,參比波長(zhǎng)λ3=532nm。

圖1 淀粉全波長(zhǎng)圖Fig.1 Full wavelength figure of starch

2.2 雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

2.2.1 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在測(cè)定波長(zhǎng)560nm、參比波長(zhǎng)659nm下分別測(cè)定吸光值,以直鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以吸光值的差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程:y=0.0069x+0.0042,R2=0.9990。

圖2 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of amylose

2.2.2 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在測(cè)定波長(zhǎng)600nm、參比波長(zhǎng)532nm下分別測(cè)定吸光值,以支鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以吸光值的差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程:y=0.0010x+0.0068,R2=0.9989。

圖3 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of amylopectin

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)四次測(cè)定,結(jié)果如表1所示。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Repetitive experimental result

由表1可以看出,通過(guò)四次實(shí)驗(yàn)測(cè)得懷山藥中直鏈、支鏈淀粉含量,相加后求百分比可以得出懷山藥中直鏈淀粉約占23.96%,支鏈淀粉約占76.04%,且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)1%,實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.4 雙波長(zhǎng)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

取已測(cè)知直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的山藥淀粉,分別在其中添加一定量的直鏈淀粉或支鏈淀粉的純品,按照1.2.6所述的實(shí)驗(yàn)方法,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Recovery rate determination result of sample

表3 準(zhǔn)確度分析Table 3 Accuracy analysis

由表2可知:無(wú)論是直鏈淀粉還是支鏈淀粉,其平均回收率均在96%～98%之間,同時(shí)在表3中可以看出,平均回收率在98%到102%之間,且回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也小于2%,在可接受范圍內(nèi)。說(shuō)明該分析方法具有較高的準(zhǔn)確度,適用于測(cè)定山藥中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

2.5 檢驗(yàn)限實(shí)驗(yàn)分析

分別直鏈淀粉和支鏈淀粉的樣品重復(fù)測(cè)定12次,結(jié)果如下:

表4 檢驗(yàn)限測(cè)定結(jié)果Table 4 Result of detection limit

根據(jù)1.6中的式(3)分別計(jì)算出直鏈淀粉的DL=0.09mg/L,支鏈淀粉的DL=1.58mg/L。證明該方法實(shí)用性很強(qiáng)，可檢測(cè)范圍較大。

3 結(jié)論

雙波長(zhǎng)分光光度法作為淀粉含量的快速測(cè)定方法,具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的特點(diǎn),可以應(yīng)用于不同品種的山藥以及其他類型的淀粉的測(cè)定,根據(jù)吸收光譜特性分析結(jié)果,新鮮山藥直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)為560nm,參比波長(zhǎng)為659nm。支鏈淀粉

的測(cè)定波長(zhǎng)為600nm,參比波長(zhǎng)為532nm。實(shí)驗(yàn)表明,顯色反映在pH3～5范圍內(nèi)影響不大。

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Determination of amylose and amylopectin content infresh yam by dual-wavelength spectrophotometry

WANG Li-xia,LI Bin,YANG Shi-wei,CAO Jin-li,LIU Xiang-hua,ZHANG Kai

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education;Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Yam starch was extracted through soak process by whitewash with yam powder which was from fresh yam as raw material. A standard curve was got based on the line relationship between absorption difference and content of starch,which the concentration cycle of standard amylose and amylopectin were used. This research had finally got 560nm for measure wavelength while 659nm for reference wavelength of amylase,600nm for measure wavelength while 532nm for reference wavelength of amylopectin according to the amylose and amylopectin complex full wavelength absorption spectra with iodine as chromogenic agent. The research about content of amylose and amylopectin in the sample with the standard curve had been worked out. According to the experiment,the RSD were 0.27% and 0.63% respectively,recovery data were 96.18% and 97.89%,while detection limit were 0.09mg/L and 1.58mg/L based on the amylose and amylopectin test. Appending accuracy analysis,allconfirmed that the dual-wavelength determining the content of amylose and amylopectin had more accurate effect.

yam;dual-wavelength;amylose/amylopectin

2014-03-24

王麗霞(1966-)，女，碩士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與功能食品。

河北省省級(jí)省?？萍己献鏖_(kāi)發(fā)項(xiàng)目。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0292-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.053