劉曉穎，馮二凱，吳洪超，馮卓，李光玉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)是判別食品(或飼料)污染程度的指標(biāo)，觀察細(xì)菌在食品(或飼料)中的繁殖動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢測(cè)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)[1，2]。在測(cè)定食品(或飼料)菌落總數(shù)實(shí)際工作中，常因檢測(cè)樣品中含有的微小顆粒沉渣與生長(zhǎng)于瓊脂內(nèi)部的菌落難以區(qū)分、部分菌落細(xì)小或菌落顏色與瓊脂較相近，給菌落計(jì)數(shù)帶來(lái)一定的困難，進(jìn)而造成實(shí)驗(yàn)誤差。

2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)能夠被細(xì)菌還原成紅色物質(zhì)[3]，添加到培養(yǎng)基中可使菌落呈紅色，觀測(cè)和計(jì)數(shù)時(shí)可使菌落與樣品細(xì)小顆粒區(qū)分開(kāi)，提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。但過(guò)量的TTC也會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，為此，培養(yǎng)基中適宜的TTC濃度是準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌菌落數(shù)的重要前提。本試驗(yàn)探討培養(yǎng)基中不同TTC濃度與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)數(shù)量的關(guān)系，研究TTC的安全用量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌(中國(guó)藥品生物制品中心)。

1.1.2試劑蛋白胨、牛肉膏(美國(guó)BD公司)；酵母浸出粉(英國(guó)OXOID公司)；氯化鈉、葡萄糖(分析純，北京化工廠)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(分析純，Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.11%TTC的配制稱取1g TTC，加入100mL蒸餾水，完全溶解后，用0.22μm濾膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。

1.2.2菌液制備將-20℃保存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的液體培養(yǎng)物分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置36±1℃培養(yǎng)24h，挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24h。比濁法確定細(xì)菌濃度約為n×108CFU/mL，以上菌液依次作10倍稀釋，制備成濃度約為n×101CFU/mL的菌液。

1.2.3不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂的配制計(jì)數(shù)瓊脂按培養(yǎng)基配方稱取后，調(diào)pH，分裝后滅菌，待冷至56℃，分別加入無(wú)菌1% TTC溶液，使終濃度分別為0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，搖勻混勻，置于46℃水浴鍋中備用。

1.2.4細(xì)菌的倒入?yún)⒄諊?guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2010操作，用1mL滅菌吸管分別取上述細(xì)菌稀釋液于2組滅菌平板內(nèi)各1mL，將46℃水浴中含不同濃度TTC的計(jì)數(shù)瓊脂(包括不含TTC)注入平板內(nèi)約25mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平板使混合均勻，同時(shí)分別將平板計(jì)數(shù)瓊脂25mL注入滅菌平板及加有1mL滅菌生理鹽水平板內(nèi)作空白和試劑對(duì)照，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌在不同TTC濃度的計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

大腸埃希菌在不同TTC濃度試驗(yàn)組中，TTC終濃度為0.002%時(shí)，菌落呈紅色，菌落大小與對(duì)照組相當(dāng)；TTC終濃度≤0.01%時(shí)，菌落數(shù)量和對(duì)照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.02%時(shí)，菌落呈黑色、點(diǎn)狀，菌落數(shù)量也明顯減少(表1)。

表1不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中大腸埃希菌生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果

Table1BacterialcolonymorphologyandnumberofEscherichiacoliindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite45460.0002乳 白Milkywhite54430.0004肉 色I(xiàn)ncarnadine44470.0006肉 色I(xiàn)ncarnadine35450.0008粉 紅Pink50430.001粉 紅Pink36460.002紅 色Red45420.004紅 色Red39380.006紅 色Red37420.008深紅色Oxbloodred4538

續(xù)表1

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.01紫 黑Purpleblack41470.02黑 色Black21360.03黑 色Black100.04黑 色Black010.05/000.06/00

2.2 金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度試驗(yàn)組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組相同，只是在TTC終濃度≤0.004%時(shí)，菌落數(shù)量和對(duì)照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.006%時(shí)，菌落數(shù)量明顯減少；TTC終濃度≥0.02%時(shí)，幾乎無(wú)菌落出現(xiàn)(表2)。

表2不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果

Table2BacterialcolonymorphologyandnumberofStaphylococcusaureusindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite47630.0002米 黃Riceyellow49380.0004肉 色I(xiàn)ncarnadine50440.0006肉 色I(xiàn)ncarnadine43390.0008粉 紅Pink35600.001粉 紅Pink44460.002紅 色Red4554

續(xù)表2

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.004紅 色Red47460.006紅 色Red31280.008深 紅Oxbloodred19220.01紫 黑Purpleblack20180.02黑 色Black120.03黑 色Black120.04/000.05/000.06/00

2.3 鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度試驗(yàn)組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組、金黃色葡萄球菌組變化基本相同。菌落數(shù)量在TTC終濃度≤0.01%時(shí)，和對(duì)照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.02%時(shí)，菌落數(shù)量和對(duì)照組相比逐漸減少(表3)。

表3不同TTC濃度計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果

Table3BacterialcolonymorphologyandnumberofSalmonellatyphimuriumindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0乳 白Milkywhite81850.0002乳 白Milkywhite77740.0004肉 色I(xiàn)ncarnadine99730.0006肉 色I(xiàn)ncarnadine6473

續(xù)表3

TTC濃度(%)TTCconcentration菌落顏色Thecolorofthecolony菌落數(shù)Colonycount0.0008粉 色Pink88720.001粉 紅Pink78740.002紅 色Red81770.004紅 色Red74670.006紅 色Red69750.008深 紅Oxbloodred77730.01紫 黑Purpleblack82660.02黑 色Black21360.03黑 色Black1070.04黑 色Black690.05黑 點(diǎn)Blackspot580.06黑 點(diǎn)Blackspot24

3 結(jié)論

3.1 在食品(或飼料)的加工、貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中被污染的細(xì)菌種類很多，包括致病菌、條件性致病菌和非致病性細(xì)菌，如埃希菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬等。歸納起來(lái)主要為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。本次試驗(yàn)選取大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌為革蘭氏陰性菌代表，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌代表。

3.2 食品(或飼料)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一些殘?jiān)⒘２豢杀苊獾乇晃?，影響了?xì)菌菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。添加一定濃度的TTC于平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中，細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能與其結(jié)合形成紅色，殘?jiān)鼊t保持原有的顏色，更有利于計(jì)數(shù)。TTC在使用時(shí)，應(yīng)配制成溶液，4℃避光保存；TTC不耐高溫，易吸潮，所以不能直接加入到培養(yǎng)基中滅菌；TTC溶液向培養(yǎng)基中添加時(shí)，培養(yǎng)基的溫度也不宜過(guò)高，否則會(huì)使培養(yǎng)基變成紅褐色，導(dǎo)致TTC失效。TTC溶液加入56℃水浴保溫的培養(yǎng)基中，使TTC與培養(yǎng)基混合均勻并冷卻到46℃時(shí)，再與待檢樣品混合，鋪板，以免細(xì)菌被燙死。

3.3 使用適宜終濃度的TTC測(cè)定菌落總數(shù)時(shí)，由于菌落呈紅色，與培養(yǎng)基顏色差別明顯，與不含TTC的培養(yǎng)基計(jì)數(shù)相比計(jì)數(shù)方便、耗時(shí)短，提高了工作效率。賈杰[4]選0.2% TTC溶液于培養(yǎng)基中，采集飲用水、酒、醬油、消毒牛奶、棒冰共105份樣品，利用TTC-涂抹法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果TTC濃度為0.2%組結(jié)果優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，但涂抹法的缺點(diǎn)是加入樣品量少，所造成的誤差較大；王曉文等[5]用浸泡濾紙法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，但紙片中TTC的量難以控制；楊慶文等[6]通過(guò)加入不同濃度的TTC得出添加0.2% TTC時(shí)為宜的結(jié)論，但TTC濃度的使用范圍較窄。本實(shí)驗(yàn)選用平板灌注法對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，TTC終濃度在0.0008%～0.004%之間的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基最佳，在該濃度下能很好地使菌落顯色，同時(shí)又不會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

[1]GB4789.2-2010,食品微生物學(xué)檢驗(yàn)[S].

[2]GB/T13093-2006,飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定[S].

[3]郭炳才.應(yīng)用TTC計(jì)數(shù)菌落的探討[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,1999,5(4):30.

[4]賈杰.應(yīng)用TTC-涂抹法測(cè)定食品中細(xì)菌總數(shù)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,34(1):126-127.

[5]王曉文,張俊偉.TTC應(yīng)用于食品菌落總數(shù)測(cè)定的研究[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào),2011,38(1):86-89.

[6]楊慶文,國(guó)譯丹,周惠新,等.不同濃度TTC平板計(jì)數(shù)瓊脂細(xì)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)觀察[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22(1):62-63.