陳英紅，王穎，姜翔之，羅浩銘

(1．吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 130012； 2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春 130021；3．長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

人參為名貴中藥材，在中國應(yīng)用人參防治各種疾病已有幾千年的歷史，人參的主要成分人參皂苷的化學(xué)及生物活性方面的研究很多。近年研究表明，人參糖蛋白具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[1]，這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)利用人參藥材提供了新的途徑。

由于糖蛋白多是親水性的生物大分子，在胃腸道環(huán)境下穩(wěn)定性差，易被胃酸和胃蛋白酶等降解，同時(shí)，由于其親水性，無法穿透小腸黏液層和上皮層組成的胞間緊密連接等生理屏障[2]。因此，如何提高糖蛋白類化合物口服吸收的生物利用度一直是醫(yī)藥學(xué)界開發(fā)新藥需要解決的瓶頸。吸收促進(jìn)劑是一類能提高胃腸道對(duì)蛋白多肽等藥物的吸收、使藥物穿過腸道的生理屏障進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)、進(jìn)而到達(dá)靶位點(diǎn)發(fā)揮藥效、提高藥物口服生物利用度的化合物[3]。離體腸段模型常用于考察促進(jìn)劑作用的部位差異及促進(jìn)劑的篩選[4]。本研究選擇了幾種不同作用機(jī)制的吸收促進(jìn)劑，以探討不同吸收促進(jìn)劑對(duì)人參糖蛋白(PGG)在腸道吸收的促進(jìn)作用，為PGG腸道吸收機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為PGG新型口服制劑進(jìn)一步開發(fā)提供新的思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

960MC型熒光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；體外透膜裝置(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院儀器室)。

1.2 試劑

癸酸鈉、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)(Sigma公司)；去氧膽酸鈉(SDCh，北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)及制品廠)；水溶性殼聚糖(脫乙酰度50%，青島海匯公司)；卵磷脂(上海浦江磷脂有限公司)。

1.3 動(dòng)物

Sprague-Dawley(SD)大鼠(♂，100只，體重250g～300g，吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腸囊處理

SD大鼠稱重，腹腔注射烏拉坦1.0g/kg，麻醉后背位固定于手術(shù)臺(tái)板上，沿腹中線剪開腹部，按以下方法分離并剪取各腸段8cm：十二指腸自幽門2cm處開始；空腸自十二指腸空腸曲下2cm處開始；回腸離盲腸上行2cm處開始；結(jié)腸段從盲腸后段1cm處開始。用氧氣飽和并預(yù)冷的臺(tái)氏液沖洗各腸段表面及腸道內(nèi)容物，剪去漿膜側(cè)的脂肪組織，備用。

2.2 供試液配制

用臺(tái)氏液分別配制1%卵磷脂、1%十二烷基硫酸鈉、1%癸酸鈉、1%去氧膽酸鈉和1%水溶性殼聚糖各促進(jìn)劑溶液。用促進(jìn)劑溶液配制供試品溶液40mg/mL。

2.3 體外透膜實(shí)驗(yàn)

參照沈騰等[5]所設(shè)計(jì)的離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并略作改?dòng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，截取約3cm長的腸囊兩端，分別用細(xì)線系緊，注入0.2mL供試液后將腸囊置于預(yù)先加有20mL臺(tái)氏液37℃預(yù)熱的夾層凹槽中(凹槽內(nèi)徑和高度分別為2cm和12cm，外接恒溫水浴，內(nèi)置攪拌子)，腸囊內(nèi)、外側(cè)通過毛細(xì)管供氧混合氣(O2∶CO2=95∶5)，開動(dòng)攪拌器使系統(tǒng)平衡10min后計(jì)時(shí)，于30min、60min、90min、120min取樣0.2mL，同時(shí)補(bǔ)充等量同溫的臺(tái)氏液。每次實(shí)驗(yàn)后測定腸囊的表面積。

2.4 測定法

配制0.154mg/mL的PGG供試品溶液，分別取供試品溶液0.05mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL，加臺(tái)氏液至10mL，在505nm處測定熒光吸收值。靈敏度：2，空白臺(tái)氏液A=0.3。以供試品溶液濃度對(duì)吸收值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.072+294.186X，r=0.9989。每隔一定時(shí)間取外液0.2mL，加臺(tái)氏液稀釋至3mL，測定505nm處熒光吸收值A(chǔ)。代入回歸方程計(jì)算透出液濃度，除以樣品濃度(百分百透過濃度為0.0267mg/mL)，得透過率。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 測定方法的選擇

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PGG通過200nm～800nm熒光掃描，在505nm有最大吸收，在0.77μg/mL～30.8μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸收值呈線性關(guān)系(圖1)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)上述5種促進(jìn)劑溶液進(jìn)行了掃描，在200nm～800nm范圍內(nèi)無吸收。表明促進(jìn)劑對(duì)測定無干擾。

圖1 PGG的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 PGG經(jīng)不同腸段滲透速率的比較

本研究采用不翻轉(zhuǎn)腸囊作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，與外翻腸囊法比較，其優(yōu)點(diǎn)在于黏膜側(cè)供給液體積小、用藥量少，適合較為貴重的大分子藥物腸吸收研究。按照“2.3”項(xiàng)下方法，分別以10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的PGG對(duì)各腸段進(jìn)行滲透速率試驗(yàn)?？疾霵GG在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收情況，確定PGG的較佳的吸收腸段。滲透系數(shù)見表1。PGG在各腸段的滲透系數(shù)大小順序?yàn)椋菏改c>空腸>結(jié)腸>回腸，其中，十二指腸和空腸的滲透系數(shù)無顯著性差異，是回腸滲透系數(shù)的1.3倍、結(jié)腸的1.2倍。說明十二指腸為PGG的較佳吸收腸段，且隨著PGG濃度的增加，各腸段對(duì)其吸收滲透系數(shù)與濃度呈非線性關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果相近[6]，說明PGG在各腸段的吸收也可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。另外，從總體上看，PGG在一定程度上能夠透過小腸和大腸，但透過量還是較低，經(jīng)檢測，2h供給液中人參糖蛋白含量與初始供給液含量比較，仍有90%以上保留在供給液中。

表1PGG經(jīng)大鼠不同離體腸段的滲透系數(shù)

Table1PermeationcoefficientsofPGGacrossratintestinalmucosaeinvitro

PGG濃度(μg/mL)Concentration十二指腸Duodenal空 腸Jejunum回 腸Ileum結(jié) 腸Colonic100.40±0.050.39±0.200.30±0.240.33±0.07200.43±0.020.41±0.180.34±0.200.37±0.11400.47±0.080.46±0.150.35±0.150.39±0.09800.41±0.070.40±0.160.32±0.190.33±0.10

3.3 吸收促進(jìn)劑對(duì)PGG腸滲透的影響

文獻(xiàn)報(bào)道，吸收促進(jìn)劑通常對(duì)小腸下段或大腸的作用效果較小腸上段好[7]．“3.2”項(xiàng)的試驗(yàn)結(jié)果表明，PGG經(jīng)十二指腸滲透最佳，故本研究選擇十二指腸和結(jié)腸考察不同促進(jìn)劑對(duì)PGG腸滲透的影響。

不同吸收促進(jìn)劑作用下，PGG經(jīng)離體十二指腸和結(jié)腸的滲透系數(shù)及增滲比計(jì)算結(jié)果顯示，各促進(jìn)劑均不同程度增加PGG透過十二指腸和結(jié)腸。以P值比較各促進(jìn)劑作用強(qiáng)弱，經(jīng)十二指腸滲透，P值大小順序?yàn)闅ぞ厶?去氧膽酸鈉>癸酸鈉>十二烷基硫酸鈉>卵磷脂；經(jīng)結(jié)腸滲透，P值大小順序?yàn)闅ぞ厶?癸酸鈉>去氧膽酸鈉>十二烷基硫酸鈉>卵磷脂。結(jié)果顯示，各促進(jìn)劑于十二指腸和結(jié)腸的增滲比高低不同，表明十二指腸和結(jié)腸對(duì)各促進(jìn)劑的作用敏感性有差別，但殼聚糖對(duì)PGG的滲透吸收和增滲比均以十二指腸最高，表明殼聚糖為PGG在腸道吸收的最佳促進(jìn)劑。

表2不同吸收促進(jìn)劑對(duì)PGG經(jīng)離體大鼠十二指腸和結(jié)腸滲透的影響

Table 2 Effect of absorption enhancers on the permeation of PGG across the rat duodenal and colonic mucosae in vitro (n=3，±s×10-6cm/s)

注：*.與對(duì)照組比較，P<0.01Note:*.Vs control group，P<0.01

4 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠的離體十二指腸是人參糖蛋白最佳吸收部位；在體外擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)中，殼聚糖對(duì)人參糖蛋白的吸收促進(jìn)作用最顯著。本研究初步闡述了幾種吸收促進(jìn)劑的作用效果，對(duì)人參糖蛋白口服給藥系統(tǒng)的深入研究及不同吸收促進(jìn)劑作用機(jī)制研究提供了依據(jù)。

[1]Ying Wang,Yinghong Chen,Hong Xu,et al.Analgesic effects of glycoproteins from Panax ginseng root in mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,148(3):946-950.

[2]Ezharul H C.Oral Nano-insulin Therapy:Current Progress on Nanoparticle-based Devices for Intestinal Epithelium-targeted Insulin Delivery[J/OL].Journal of Nanomedicine and Nanotechnology,2012-01-11[2014-12-15].http:∥dx.doi.org/10.4172/2157-7439.S4-007.

[3]黃敏,吳偉.蛋白多肽類口服給藥系統(tǒng)[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2004,13(3):183-187.

[4]Miura,Kanebako,Shirai,et al.Influence of particle design on oral absorption of poorly water-soluble drug in a silica particle-supercritical fluid system[J].Chem Pharm Bull,2011,59(6):686-691.

[5]Gurny R and Junginger HE.Bioadhesion-Possibilities and Future Trends[M].Stuttgart:Wissenchaftliche Verlagsgesellschaft,1990:186-195.

[6]賴臖,廖正根,梁新麗,等.吸收促進(jìn)劑對(duì)葛根素腸吸收的研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,21(4):30-32.

[7]Aungst B J.Intestinal permeation enhancers[J].J Pharm Sci,2000,89(4):429-442.