張廣遠(yuǎn)，孫士淋，劉昕，樊紅波，王玉，管清香

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021)

現(xiàn)代藥理研究表明，葛根黃酮有降低血管阻力、改善心腦血液循環(huán)、降低心肌耗氧量等多種藥理作用，但其難溶于水，生物利用度低，限制了臨床應(yīng)用[1]。固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticle，SLN)為20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新型微粒給藥系統(tǒng)，近年來已受到越來越多的關(guān)注，尤其針對(duì)水難溶性藥物。與其他微粒給藥系統(tǒng)相比，SLN不僅可提高藥物生物利用度，還具有控制釋放、靶向作用等優(yōu)點(diǎn)[2]。為了提高葛根黃酮的口服生物利用度，我們制備了葛根黃酮固體脂質(zhì)納米粒(Puerarin flavonoids solid lipid nanoparticle，PF-SLN)，其平均粒徑為(263.82±3.6)nm，體外釋放緩慢，符合Higuchi方程[3]。大鼠體內(nèi)藥動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，PF-SLN可顯著提高葛根黃酮的口服生物利用度，其相對(duì)生物利用度為PF混懸液的2.73倍[4]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)(Central composite design，CCD)和效應(yīng)面(Response surface)優(yōu)化法是一種常用的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，預(yù)測性較好[5]，本試驗(yàn)主要采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法篩化PF-SLN的最佳處方。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀、SPD-10A型紫外檢測器(日本島津公司)；UNIC2100型紫外分光光度計(jì)(上海天普分析儀器有限公司)；TGL-16G型低溫超速離心機(jī)(德國艾本德股份公司)；90-3型恒溫磁力雙向攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)。

葛根黃酮(西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司，純度66.7%)；葛根素對(duì)照品(北京生物制品檢定所)；泊洛沙姆188(德國BASF公司)；硬脂酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；注射級(jí)大豆卵磷脂(上海愛康精心化工有限公司)；其它試劑為分析純。

2 方法

2.1 固體脂質(zhì)納米粒的制備

取處方量泊洛沙姆188溶于適量水中，(75±2)℃恒溫?cái)嚢枞芙?，作為水相；處方量的葛根黃酮、卵磷脂和硬脂酸溶于適量乙醇中，作為有機(jī)相。在恒速攪拌下，將有機(jī)相以恒定速度注入至水相，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?0min后，濃縮至40mL，并迅速加入一定體積(0～2)℃的水相中，繼續(xù)攪拌60min，即得PF-SLN混懸液。

2.2 色譜條件

C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇-水(40∶60)；流速1.0mL/min；檢測波長250nm；柱溫22℃；進(jìn)樣量20μL。

2.3 包封率的測定

取PF-SLN混懸液，12 000r/min離心30min，取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜濾過。精密量取續(xù)濾液1mL，甲醇定容至5mL，混勻。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，樣品平行實(shí)驗(yàn)3次。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化納米粒處方

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定脂質(zhì)硬脂酸(X1，g)、乳化劑大豆卵磷脂(X2，g)及泊洛沙姆188(X3，g)的用量對(duì)納米粒包封率(Y)影響較大。以這3種輔料用量為考察對(duì)象，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定因素水平(表1)。

表1CCD因素水平表

Table1IndependentvariablesandlevelsofCCD

因 素Factors水 平 Levels-1.732-1011.732X10.32680.4000.5000.6000.6732X20.05670.0750.1000.1250.1433X30.12680.2000.3000.4000.4732

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1專屬性考察按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別將葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)、空白SLN離心濾液(B)及PF-SLN離心濾液(C)分別進(jìn)樣。結(jié)果，輔料不干擾葛根素的測定(圖1)。

3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取葛根素對(duì)照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，分別進(jìn)樣。以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=13 091X+6249.2(R2=0.9999)。結(jié)果可見，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系。

3.1.3精密度試驗(yàn)精密吸取葛根素對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。計(jì)算RSD值為0.94%。

3.1.4回收率試驗(yàn)精密量取PF-SLN供試液(葛根素含量為2.13μg/mL)，精密加入葛根素對(duì)照品溶液，分別配制成低濃度(0.12μg/mL)、中濃度(2.42μg/mL)、高濃度(4.86μg/mL)溶液。進(jìn)樣測定，求得平均回收率為98.52%，RSD為0.77%。

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果及處方優(yōu)化

以脂質(zhì)硬脂酸(X1，g)、乳化劑大豆卵磷脂(X2，g)及泊洛沙姆188(X3，g)為自變量，考察其用量對(duì)包封率(Y，%)的影響，按“2.1”項(xiàng)下方法制備納米粒，測定包封率(表2)。

采用SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件，分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸，得回歸方程：Y=0.296+0.282X1+0.526X2+0.091X3(R2=0.662，P=0.023)，相關(guān)性較差。刪除P>0.2項(xiàng)，二項(xiàng)式方程重新擬合，得回歸方程為：Y=-0.451+3.06X1-0.122X2+0.868X3+3.5X1X2-0.525X1X3+1.600X2X3-2.975X12-7.873X22-1.125X32(R2=0.952，P=0.001)，因變量和自變量相關(guān)性較好。根據(jù)回歸方程可知，因素X1、X2、X3對(duì)包封率均有影響，其中因素X1對(duì)包封率的影響較為顯著，X3其次。根據(jù)擬合方程，以O(shè)rigin 7.0軟件繪制包封率與各因素間的三維效應(yīng)面曲線圖(圖2)。

表2星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 CCD experiments and results

圖2 包封率Y和各因素的三維效應(yīng)面

由圖2可見，X1與X2，X1與X3對(duì)包封率的影響存在交互作用。各因素最佳范圍分別為：X1=0.50g～0.65g，X2=0.125g～0.14g，X3=0.25g～0.45g。綜合考慮，確定3因素的最佳驗(yàn)證工藝參數(shù)分別為：X1=0.50g，X2=0.13g，X3=0.35g。制備3批PF-SLN，測得平均包封率為(67.53±0.12)%。二項(xiàng)式方程的預(yù)測值為71.0%，二者偏差小于5%。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所得的擬合方程可較

好預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.3 輔料對(duì)納米粒影響

研究中發(fā)現(xiàn)，硬脂酸及泊洛沙姆188的用量可直接影響納米粒混懸液的穩(wěn)定性。硬脂酸用量過多時(shí)，納米?；鞈乙憾虝r(shí)間內(nèi)出現(xiàn)沉降現(xiàn)象。用量較少時(shí)，一定程度上可增加納米混懸液的穩(wěn)定性，但包封率也隨之降低。一定程度上，泊洛沙姆188的加入可改善納米?；鞈乙旱姆€(wěn)定性。卵磷脂的加入量過多也可致包封率下降，可能與過量卵磷脂形成膠束有關(guān)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)聯(lián)合效應(yīng)面優(yōu)化法可設(shè)計(jì)出較為理想的實(shí)驗(yàn)方案，可在今后的實(shí)驗(yàn)過程中推廣使用。

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