曹冬伸，趙柏林，曲 萍，胡冬梅，王文超，宋曉暉＊，潘樹德＊

（1.沈陽農業(yè)大學，遼寧沈陽110866；2.中國動物疫病預防控制中心，北京102609）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）俗稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起山羊、綿羊及野生小反芻動物發(fā)生的以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征的急性接觸性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）曾將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。1942年，Dennec G 等首次報道了非洲西部象牙海岸發(fā)生的PPR 疫情。此后，PPR 幾乎遍及撒哈拉沙漠到赤道的所有國家。近年來，PPR 全球疫情趨于復雜，老撾、孟加拉國、印度、尼泊爾、俄羅斯、巴基斯坦和緬甸等我國周邊多個國家該病呈地方性流行態(tài)勢。2007年PPR 首次由境外傳入我國西藏阿里地區(qū)［1］，疫情很快被迅速撲滅，之后在2008年和2010年再次由境外傳入并引發(fā)疫情。2013 年底，PPR 由境外傳入我國新疆地區(qū)，之后迅速蔓延至全國多個省份。

目前，PPR 防控主要以弱毒疫苗免疫為主。1980年，研究人員通過將Nigeria 75／1 分離株在Vero細胞上連續(xù)傳代成功獲得了PPRV 致弱毒株，之后在此基礎上制成了第一株PPRV 弱毒疫苗?；贜igeria 75／1的致弱株疫苗目前仍在非洲地區(qū)廣泛使用，由于亞洲國家境內流行的病毒譜系均為IV 系，接種Nigeria 75／1弱毒疫苗后可能會增加各譜系病毒的重組、突變和毒力增強的幾率，因此，印度研究人員使用基因IV 分離株Sungri／96、Arasur／87、Coimbatore／97 等，在Vero 細 胞 上 傳 代 致弱研制成了3株PPRV 弱毒疫苗，該疫苗目前在印度廣泛使用。弱毒疫苗的應用在PPR 疫病控制中發(fā)揮了重要作用，但由于產生的抗體無法同野毒感染抗體區(qū)分，給疫病的監(jiān)測和凈化工作帶來了困難。因此開發(fā)新型基因工程苗成為近年來的研究熱點，并且在重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、反向遺傳致弱活疫苗、核酸疫苗等研究領域均取得了一定的進展。

1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是指以能誘導機體產生抗體的病原體功能性結構蛋白制成的疫苗。亞單位疫苗不含病毒基因，因此具有安全性高、方便規(guī)模制造等優(yōu)點，是目前開發(fā)新型疫苗的一個重要手段。PPRV 是單股負鏈RNA 病毒，同其他麻疹病毒科成員一樣，具有囊膜，病毒基因組共編碼6種結構蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、囊膜基質蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）和血凝素（H）。目前在這些結構蛋白的功能研究方面都取得了一些進展。N 蛋白包裹著病毒RNA，是最主要的免疫原蛋白，但是針對N 蛋白的抗體，并不能抵抗病毒感染，因此該蛋白主要用于診斷試劑的研究；H 蛋白是血凝素蛋白，能夠結合宿主細胞表面的受體，啟動膜融合，使病毒基因組進入細胞中，H 蛋白是PPRV 感染的最主要免疫原性蛋白，也是引起體液免疫的主要蛋白；F蛋白主要引起細胞免疫。目前PPR 亞單位疫苗的研究主要集中于H 蛋白和F蛋白，已經成功構建了能夠表達H 蛋白、F 蛋白以及F 和H 蛋白的羊痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等重組病毒，在實驗條件下接種動物，能夠誘導接種動物產生免疫保護力并且沒有副作用。

Diallo A 等［2］將PPRV 的H 基 因 和F 基 因 整合到山羊痘病毒（CPV）上獲得表達PPRV H 蛋白和F 蛋白的重組CPV 疫苗，該類疫苗免疫接種羊群可以有效保護羊群免受PPRV 和CPV 的感染，并且低PFU 劑量接種也可產生針對PPRV 的完全保護。Caufour P等［3］以CPV－Kenya sheep－1（KS－1）為基礎成功構建了表達PPRV－Nigeria 75／1毒株的F蛋白和H 蛋白的重組CPV，將這兩株重組病毒以103TCID50／頭份的劑量接種山羊，可使山羊獲得針對CPV 和PPRV 的免疫保護力，免疫保護可持續(xù)3周時間。Qin J L 等［4］將包含人巨細胞病毒（hCMV）啟動子和BGH 早期mRNA 的多聚腺苷酸化信號的PPRV H 蛋白表達系統(tǒng)插入到犬2型腺病毒非復制關鍵區(qū)的E3區(qū)的SSPI的位點，構建了表達PPRV H 蛋白的重組犬2型腺病毒，用該重組犬2型腺病毒免疫接種山羊可產生高水平的免疫抗體，抗體水平可持續(xù)長達7個月的時間，并且在免疫接種山羊體內沒有分離出腺病毒。Wang Y等［5－6］分 別 以 腺 病 毒（AV）為 載 體，構 建 了 表 達PPRV 的F蛋白、H 蛋白以及F－H 融合蛋白的重組腺病毒疫苗，以該重組病毒免疫接種綿羊或山羊，可使受免疫動物產生有效的抗病毒中和抗體，并且沒有出現臨床副反應。Rojas J M 等［7］發(fā)現用同時表達PPRV F和H 的重組腺病毒疫苗免疫效果比用只表達F蛋白或H 蛋白的重組腺病毒的好，免疫保護可持續(xù)長達21周，并且可以同時激活機體的細胞免疫和體液免疫。Rahman M M 等［8］以家蠶角體病毒（BmNPV）表達系統(tǒng)表達PPRV 的F蛋白和牛瘟病毒（RPV）H 蛋白融合蛋白，免疫接種小鼠后，小鼠能夠產生針對PPRV 和RPV 的特異性抗體。

目前研制成功的PPRV 亞單位疫苗主要分為PPRV H 蛋白亞單位疫苗和PPRV F－H 融合蛋白亞單位疫苗，該兩種亞單位疫苗在臨床上均可完全保護羊群不受PPRV 的感染，又因其不含有PPRV的全基因組，因此該亞單位疫苗具有免疫保護性強，安全性高，并可通過血清學檢測免疫羊群是否感染PPRV 野毒等優(yōu)點。但因其在機體內產生的高水平抗體時間為2個～7個月，故此類抗體在有效保護時間上存在一定缺陷。

2 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus－like particle，VLP）是一種空心顆?；虬铑w粒結構，由病毒結構蛋白組裝而成，形態(tài)上與真正病毒粒子相似，因缺乏病毒基因組而不能自主復制。與單獨的抗原蛋白和多肽相比較，病毒樣顆粒表現出與天然病毒更相似的構象表位，以接近真實構象的形式呈遞給免疫細胞，更容易被機體免疫系統(tǒng)識別，從而有效誘導機體產生免疫保護反應，因此具有更強的免疫原性和生物學活性，并且不存在基因重組或重配和毒力返強的可能，安全性高，是安全的候選疫苗。Tiollais M L等［9］成功開發(fā)出第一個基于VLP的疫苗－乙肝病毒表面抗原VLP（HBsAg）疫苗，自此病毒樣顆粒疫苗的研究迅速發(fā)展。目前已經建立了細菌、酵母、桿狀病毒／昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等基于不同表達系統(tǒng)的病毒樣顆粒系統(tǒng)，并且已經成功包裝出了艾滋病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、藍舌病病毒等病毒的病毒樣顆粒［10］。

王秋霞等［11］構建了表達PPRV 4 個結構蛋白的 真 核 表 達 載 體 pCAGGS／N、pCAGGS／M、pCAGGS／F 和pCAGGS／H，將這4個重組質粒共轉染Vero細胞，成功裝配釋放了PPRV VLP，研究還發(fā)現M 蛋白是PPRV VLP正確的裝配和釋放所必須的。隨 后 劉 拂 曉 等［12－15］利 用Bac－to－Bac○R桿 狀病毒表達系統(tǒng)成功構建了共表達M 和H 蛋白的病毒BV－MH 和共表達M、H、N 蛋白的病毒BVMHN，通過Western blot、透射電鏡等技術證明這兩種重組病毒在昆蟲細胞中均可表達相應的蛋白并自行組裝成VLP（VLP－MH、VLP－MHN），并以出芽方式釋放。將VLP－MH、VLP－MHN 通過蔗糖密度梯度離心提純后免疫小鼠發(fā)現，這兩種VLP均可誘導小鼠產生特異性抗H、N 蛋白抗體和中和性抗體，但VLP并不能誘導小鼠產生干擾素和白細胞介素。Li W C等［16］利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構建了包含PPRV M 蛋白、F 蛋白、H 蛋白的VLPs，用構建的VLPs皮下免疫接種山羊和小鼠后，山羊和小鼠體內針對PPRV 的IgG 抗體顯著升高，在4周內能夠獲得針對PPRV 的完全免疫保護。

PPRV 病毒樣顆粒疫苗，在抗原形態(tài)上表現為抗原蛋白與病毒顆粒保持一致，因此其具有完整PPRV 的免疫原性，又因其不含病毒基因組，故該疫苗較弱毒活疫苗具有安全性高，可通過血清學檢測免疫羊群是否感染PPRV 野毒等優(yōu)點。但因其在機體內不能連續(xù)產生病毒樣顆粒，使得該疫苗在保護周期上表現出一定的短板。

3 反向遺傳致弱活疫苗

反向遺傳致弱活疫苗是指以反向遺傳技術對病毒的基因組進行定向改變，然后通過病毒拯救技術得到病毒基因突變或缺失的毒株，并用其制備疫苗。該疫苗兼具弱毒苗的優(yōu)點，且目的性更明確，減毒效率更高，毒力恢復的幾率更小，是目前發(fā)展迅速的新型疫苗研究方向。1981 年，Racaniello等利用克隆的脊髓灰質炎病毒全長cDNA 轉染哺乳動物細胞首次成功的拯救了脊髓灰質炎病毒，開創(chuàng)RNA 病毒反向遺傳學研究的先河。隨著反向遺傳操作技術的興起和發(fā)展，30 多年來，幾乎針對所有重要的RNA 病毒，如口蹄疫病毒、流感病毒等都成功建立了相應的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過構建RNA 病毒的感染性cDNA，在DNA 水平上進行體外操作，將病毒基因組中的毒力基因進行敲除或者替換，就可以獲得毒力減弱的疫苗株，為研究和開發(fā)RNA 病毒疫苗提供了新思路和新手段。

Radecke L S等［17］利用T7RNA 聚合酶系統(tǒng)首次成功建立了麻疹病毒（Measles virus，MV）反向遺傳操作系統(tǒng)，隨后麻疹病毒屬其他成員的反向遺傳操作系統(tǒng)也相繼被建立起來，目前成功構建了MV、RPV、CDV、PPRV 等病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)［18］。對于PPRV 反向遺傳操作系統(tǒng)建立的關鍵步驟是病毒基因組全長cDNA 的克隆，目前多采用“分段克隆”的方法，即將PPRV 病毒全基因分片段克隆，并將得到的病毒基因片段通過雙酶切連接到真核表達載體上，測序并確定序列正確后通過共轉染細胞成功拯救出病毒。Hu Q 等［19］通過該方法成功構建了PPRV 的反向遺傳系統(tǒng)，并成功拯救獲得了能表達綠色熒光蛋白（eGFP）的Nigeria 75／1 毒株。此后Yin C 等［20］還利用該系統(tǒng)成功構建了表達口蹄疫病毒（FMDV）VP1 蛋白的PPRV 重組病毒，該重組病毒可在體外正常增殖，并且能夠表達口蹄疫病毒VP1 蛋白。重組病毒誘導山羊產生PPRV 中和抗體的免疫原性也沒受到影響，免疫山羊后可同時檢測到針對FMDV 和PPRV 的中和抗體，攻毒試驗表明該疫苗可完全保護山羊免受FMDV 野毒和PPRV 野 毒 的 攻 擊。Muniraju M 等［21］成功構建了PPRV 病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，并成功拯救出H 蛋白77位半胱氨酸定點突變的Nigeria75／1毒株的弱毒株，以該毒株為疫苗接種羊群，羊群可獲得針對PPRV 的完全保護，并可通過競爭ELISA 方法區(qū)別疫苗毒和野毒。

PPRV 反向遺傳致弱活疫苗利用病毒反向遺傳技術，構建PPRV 拯救平臺，通過該平臺可成功拯救由基因突變或缺失致弱的PPRV，并可將該弱毒制作弱毒活疫苗。由該方法制備的PPRV 弱毒活疫苗從基因水平解決了弱毒活疫苗在動物機體內的弱毒返強問題。同時該方法還可根據不同基因型的PPRV 制備相應PPRV 反向遺傳致弱活疫苗。該疫苗有效的解決了弱毒活疫苗的安全性問題，同時保留了弱毒活疫苗的全部優(yōu)點，更為突出的優(yōu)點是可針對基因突變的PPRV 制備相應的PPRV 反向遺傳致弱活疫苗。該疫苗的缺點為不能通過血清學檢測免疫羊群是否感染PPRV 野毒。

4 核酸疫苗

1990 年，Wolff 等 報 道 將 純 化 的DNA 或RNA 通過肌肉注射到小鼠體內，載體上的基因能在體內表達并可持續(xù)數月甚至終生，這一發(fā)現為新型疫苗的開發(fā)開拓了新思路，也標志著核酸疫苗的誕生。核酸疫苗是將編碼某種抗原的基因制成疫苗，免疫動物后該外源基因可在宿主體內表達抗原，從而誘導機體產生特異性抗體。相對于傳統(tǒng)疫苗，核酸疫苗可同時激活細胞免疫和體液免疫，更接近于自然免疫反應，且在抗原呈遞過程中無抗原表位變化。目前，在流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、結核桿菌及肺炎支原體等病原的核酸疫苗研究領域均取得了一定的進展，其中部分疫苗也進入了臨床試驗階段。

朱學亮等［22］構建了表達PPRV 的F、H、M 蛋白 的 重 組 真 核 表 達 質 粒pEGFP－F、pEGFP－H 和pEGFP－HM＋FM，用重組質粒免疫山羊，能夠誘導機體產生特異性抗體，并且與傳統(tǒng)弱毒疫苗免疫相比，免疫羊在免疫后第4周血清抗體達到峰值，之后逐漸下降，而弱毒疫苗免疫山羊的血清抗體在免疫后第3周達到最高峰值，之后開始下降，研究還發(fā)現3種重組真核表達質粒免疫羊的抗體效價高于弱毒疫苗免疫羊。阮洋等［23］構建了表達PPRV 的F、H蛋白的真核重組質粒pCAGGS－H、pCAGGS－F，用重組質粒免疫小鼠，能夠誘導小鼠產生特異性抗體，研究還發(fā)現H 蛋白的重組表達質粒的免疫原性強于F蛋白的。楊香芳構建了表達PPRV F 蛋白的重組質粒pCAGGS－F，該重組質粒在有無佐劑CpG的情況下，均能誘導小鼠產生較高的抗體水平。Wang Y 等［24］將PPRV 的H 基因插入到pSCA1質粒上，通過塞姆利基森林病毒（SFV）復制子構建了PPR 自殺性DNA 疫苗，將該質粒轉染BHK－21細胞后可表達有生物活性的PPRV H 蛋白，將該疫苗通過肌肉注射免疫Balb／c小鼠，能夠在小鼠體內檢測到抗H 蛋白的特異性抗體，并能誘導淋巴細胞增殖和產生細胞免疫。PPRV 核酸疫苗的優(yōu)點表現為免疫機體后產生抗體迅速，機體產生抗體的效價高，可通過血清學檢測確認免疫羊群是否感染PPRV野毒，同時還具有制備周期短，儲存條件簡單等。但因該疫苗為重組質粒核酸疫苗，使得其在機體會受到核酸酶的降解，降低其對動物機體的保護周期。

5 展望

2011年FAO 和OIE 聯合發(fā)布全球根除RPV計劃，成為動物疫病防控歷史上的里程碑?？紤]到從病原學特性及致病機理等方面同RPV 的相似性，很多學者提出PPR 可以作為下一個全球最有可能消滅的動物疫病。在廣泛使用弱毒疫苗免疫的情況下如何實施根除計劃，需要堅實的理論基礎和有力的技術手段支持，因此，針對于PPRV 的致病機理的深入研究更加重要，并且以此為基礎的新型疫苗的開發(fā)以及特異性診斷技術的研究尤為迫切。就筆者看來，在廣泛使用弱毒疫苗免疫的情況下，可通過血清學檢測區(qū)分疫苗毒和野毒株感染的基因工程疫苗將是PPR 疫苗發(fā)展的方向，上述4種基因工程疫苗中，除反向遺傳致弱活疫苗外其余3種疫苗均可通過血清學方法檢測羊群是否感染PPRV 野毒，因此這3種疫苗可在建立PPR 無疫病區(qū)時發(fā)揮積極作用。反向遺傳致弱活疫苗是完全保留了PPRV免疫原性的活疫苗，并且在宿主體內復制不會出現毒力返強的現象，較傳統(tǒng)疫苗相比其安全性極大增強，并可針對不同基因型的PPRV 快速制備針對性較強的疫苗，迅速控制疫情的發(fā)展，因此PPRV 反向遺傳致弱活疫苗是未來PPR 預防及疫情控制研究的一個新熱點。

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