晁旭董昌虎李宏任清維鄭旭銳王國全

陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織miRNA-146a表達(dá)的影響*

晁 旭△董昌虎△李 宏△任清維▲鄭旭銳王國全

陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

目的：檢測加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織的病理和miRNA-146a表達(dá)的影響。方法：加味四逆散治療二甲基亞硝胺( DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠后，通過HE染色觀察治療前后肝組織病理變化，并通過RT-PCR技術(shù)檢測miRNA-146a的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，加味四逆散治療組大鼠肝組織匯管區(qū)可見輕度炎癥，纖維結(jié)締組織增生程度較治療前減輕，有顯著性差異(P≤0.05)。治療后的大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達(dá)明顯升高。結(jié)論：加味四逆散科通過調(diào)節(jié)miRNA-146a的表達(dá)實現(xiàn)對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

MicroRNA (miRNA)是一類長度為18-26nt非編碼RNA，它可與靶基因3，端非編碼區(qū)的特異序列結(jié)合，對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控，進而影響細(xì)胞的多種生理和病理過程[1,2]。研究表明，miRNA這一轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、脂代謝/脂肪酸代謝等一系列相關(guān)通路在許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。有關(guān)miRNA在肝臟疾病的發(fā)生和治療中的作用已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點。

miRNA-146a基因是位于人體5號染色體LOC285628基因的第二個外顯子區(qū)，它作為免疫和炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，有助于自體免疫疾病的恢復(fù)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[4-5]。miRNA-146a 可以通過激活Smad4調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞，進而導(dǎo)致肝纖維化[6]。

加味四逆散是臨床上用于治療慢性病毒性肝炎的中藥復(fù)方，具有良好的防治肝纖維化作用[7-9]。但是，加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織中miR-146a表達(dá)的影響及其生理意義尚未見文獻(xiàn)報道。本研究以二甲基亞硝胺( DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠為材料，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，檢測加味四逆散治療前后肝組織中miRNA-146a的表達(dá)，探討加味四逆散對miR-146a表達(dá)的影響。

1 材料與方法 1.1 藥品及試劑 加味四逆散由黃芪、丹參、姜黃、桃仁、柴胡、甘草、白芍、枳殼八種中藥材組成，組方中各種藥物的質(zhì)量比為10∶10∶5∶2.5∶1. 5∶1∶5∶2.5。所有藥物均購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)本院中藥教研室鑒定。所有藥物稱量好后，加注射用水400 mL，煎煮20 min后，取濾液200 mL。再按上述操作重復(fù)煎煮1次。然后將兩次煎煮的濾液混合，水浴蒸發(fā)至濃度為3.5 g /mL。秋水仙堿、TRIzol Regent購自美國Invitrogen公司、qRT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司、二甲基亞硝胺購自Sigma-Aldrich(中國)公司、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 肝纖維化大鼠制備 60只清潔級SD大鼠(體重為180 ± 20 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組10只。分別為空白對照組、模型對照組、加味四逆散大劑量組、加味四逆散中劑量組、加味四逆散小劑量組和秋水仙堿組。除空白對照組外，其余各組動物均以10 mL·kg-1體重的劑量灌胃DMN (5 g·L-1)，每日1次，每周連續(xù)3d，連續(xù)灌服4周。

1.3 給 藥 空白對照組和模型對照組均以4 mL·kg-1體重的劑量進行生理鹽水灌胃； 秋水仙堿組以0.01 mg·kg-1體重的劑量進行灌胃給藥；加味四逆散小劑量組、中劑量組和大劑量組分別以5 mL·kg-1、10 mL·kg-1和15 mL·kg-1體重的劑量灌胃加味四逆散煎煮液。以上各組用藥均1次/d，連續(xù)給藥30 d。

1.4 病理標(biāo)本制作 給藥結(jié)束后，處死動物，取部分新鮮的肝組織用生理鹽水沖洗后，10%的甲醛固定，然后進行石蠟包埋，最后進行HE染色。按照病理組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[10]分析治療前后肝組織纖維化程度。

1.5 miRNA-146a表達(dá)分析 取各組實驗動物新鮮肝組織，用TRIzol 試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA分別按1、10、100 和1 000的倍數(shù)稀釋，然后在ABI 7300 Real-timePCR 儀( Applied Biosystems) 進行PCR。miRNA-146a引物為5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3'，下游引物為5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3')，內(nèi)參基因U6 small nuclear RNA( snRNA)的上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')。反應(yīng)完后，計算各組樣品中miRNA-146a 和U6snRNA 的平均Ct值，然后用U6 snRNA對模型組和治療組樣品中miRNA-146a的Ct 值進行校正，得出個實驗組的ΔCt，再進行歸一化處理，得到ΔΔCt，最后用相對定量法( RQ = 2-ΔΔCt) 計算miRNA-146a 基因表達(dá)的差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 大鼠癥狀表現(xiàn) 給藥期間，空白組大鼠皮毛光滑，大便及飲食飲水量正常。模型對照組動物皮毛凌亂無光澤，飲食飲水量明顯減少、反應(yīng)遲鈍、糞便稀薄。秋水仙堿治療組動物治療3周后，進食、攝水量正常，大便正常，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)。加味四逆散小劑量治療組與空白對照組動物相比較，生活狀態(tài)無明顯區(qū)別。而加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組動物3周后，進食、攝水量和大便趨于正常，生活狀態(tài)比治療前顯著改善。

2.2 組織病理學(xué)分析結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，模型組動物肝組織匯管區(qū)及小葉內(nèi)有中度炎性細(xì)胞浸潤；大量膠原沉積于匯管區(qū)，呈較寬的條索狀纖維深入肝小葉。加味四逆散小劑量治療組與模型組動物肝組織結(jié)構(gòu)無顯著差異。而與模型組比較，秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠僅在匯管區(qū)可見輕度炎癥，纖維結(jié)締組織增生程度較治療前明顯減輕。該結(jié)果證實了加味四逆散組對肝纖維化良好的治療作用。

表1 各組大鼠肝臟組織纖維化分級

組 別n肝纖維化分級-±+空白對照組模型對照組秋水仙堿組加味四逆散小劑量組加味四逆散中劑量組加味四逆散大劑量組1010101010101003022003134022132041411

2.3 肝組織中miRNA-146a的表達(dá) 肝組織中miRNA-146a的表達(dá)結(jié)果顯示，相對于空白對照組，二甲基亞硝胺( DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達(dá)顯著降低(P< 0.05)。秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達(dá)明顯升高，與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,見圖1。

圖1 各實驗組大鼠肝臟組織中miRNA-146a的表達(dá)

3 討 論 近年來，隨著遺傳學(xué)及肝纖維化機制研究的深入，microRNA(miRNA)在肝纖維化進程中的作用逐漸被重視。Microarry分析結(jié)果顯示，相對于靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞(HSCs)，被TGF-βl激活的HSCs中miR-146a 的表達(dá)顯著地下調(diào)[11]。進一步研究顯示，miRNA-146a以Smad4為作用靶點，通過TGF-βl/Smads信號通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖；其機制是miR-146a可以Smad4 mRNA的3'端的非編碼區(qū)結(jié)合，從而使Smad4基因翻譯失活[12-13]。

加味四逆散是在臨床上用于治療肝纖維化療效確切的中藥方劑，具有防止肝纖維化形成、阻斷肝纖化發(fā)展、逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程等顯著效果。本研究結(jié)果顯示，相對于空白對照組，二甲基亞硝胺( DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中miRNA-146a 的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；而秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠肝組織中miRNA- 146a的表達(dá)明顯升高。該結(jié)果提示我們，加味四逆散通過調(diào)節(jié)miRNA-146a的表達(dá)，實現(xiàn)對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。但其具體機制，還需進一步研究。

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(收稿2014-06-11；修回2014-07-25)

Expression of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Chao XuDong ChanghuLi Honget al

Objective：To study the significance of pathological changes and miRNA-146a expression in liver tissue of Hepatic Fibrosis in Rats treated with Jiawei Sini powder. Methods ：The pathology changes were observed by HE staining and expressions of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder were detected by SYBR Green quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ( qRT-PCR) analysis．Results： There were only mild inflammation in portal area and ease of fibrous connective and the expression of the miRNA-146a significantly increased in liver tissue of hepatic fibrosis rats treated with Jiawei Sini powder.Conclusion ：Jiawei Sini powder could regulate the expression of miRNA-146a to inhibit hepatic fibrosis.

Jiawei Sini powder Hepatic fibrosis miRNA-146a expression Animal,experiment Rats

*咸陽市科學(xué)技術(shù)研究計劃項目(2014k04-02)

加味四逆散 肝纖維化 miRNA-146a 表達(dá) 動物，實驗 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.057

△陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

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