李芳洪昆黃瓅蘇曉麗胡成平(.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科　河南鄭州　450000;.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院　湖南岳陽(yáng)　44000;.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科　湖南長(zhǎng)沙　40008)

氯化鈷化學(xué)乏氧對(duì)人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲、遷徙能力的影響

李芳1洪昆2黃瓅3蘇曉麗3胡成平3
(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科河南鄭州450000;

2.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院湖南岳陽(yáng)414000;
3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科湖南長(zhǎng)沙410008)

【摘要】目的探討氯化鈷化學(xué)乏氧對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)及遷徙、侵襲能力的影響。方法采用氯化鈷(CoCl2)建立人肺腺癌A549細(xì)胞體外化學(xué)乏氧模型。首先通過(guò)倒置相差顯微鏡、電鏡、MTT法及流式細(xì)胞學(xué)觀察CoCl2對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)、增殖及細(xì)胞周期的影響;進(jìn)一步利用Transwell小室模型檢測(cè)CoCl2對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷徙能力的影響。結(jié)果與常氧對(duì)照組相比，200 μmol/L CoCl2化學(xué)乏氧組A549細(xì)胞光鏡下較稀疏，電鏡下出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及自噬泡形成等微觀結(jié)構(gòu)改變，生長(zhǎng)曲線低平、增殖緩慢，G1期細(xì)胞比例增多、S期細(xì)胞比例減少;遷徙及侵襲能力增強(qiáng)。結(jié)論CoCl2化學(xué)乏氧抑制人肺A549細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)G1/S周期阻滯，增強(qiáng)A549細(xì)胞的侵襲及遷徙能力。

【關(guān)鍵詞】氯化鈷;肺腺癌;增殖;侵襲;遷徙

肺癌是目前世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且是引起癌性死亡的首要原因，在男性和女性癌性死亡原因中分列第1位和第2位［1］。在常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌的病理類(lèi)型中，肺腺癌的發(fā)病率明顯增加［2］。然而，由于肺癌細(xì)胞具有惡性增殖及早期即遠(yuǎn)處侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點(diǎn)［3］，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體性腫瘤普遍存在乏氧微環(huán)境，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，采用氯化鈷(CoCl2)建立體外A549細(xì)胞化學(xué)乏氧模型，觀察乏氧微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步研究其機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑人肺腺癌A549細(xì)胞株(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)，熱滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，碘化吡啶(PI)、氯化鈷(CoCl2，分子量237.93，美國(guó)Sigma公司)，F(xiàn)N(美國(guó)Roche公司)，Transwell小室(美國(guó)Millipore公司)，溴化二甲基噻唑爾本四氮唑(MTT)(美國(guó)AMRESLO公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

1.2研究方法

1.2.1 A549細(xì)胞乏氧培養(yǎng)與分組A549細(xì)胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientific公司)中培養(yǎng)，80%匯合時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使其同步化后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含終濃度為0、200 μmol/L CoCl2［4］的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其中0 μmol/L CoCl2組為常氧組;200 μmol/L CoCl2組為乏氧組。

1.2.2 A549細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)檢測(cè)常氧組及乏氧組A549細(xì)胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，從培養(yǎng)箱中取出。

1.2.2.1倒置顯微光鏡下觀察各組A549細(xì)胞的形態(tài)將上述細(xì)胞放置在倒置顯微鏡(日本Olympus公司)物鏡下，按放大倍數(shù)，依次通過(guò)目鏡觀察A549細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2.2透射電鏡觀察各組A549細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)將上述細(xì)胞給予1×D－Hank’s漂洗1～2次后，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成均勻的細(xì)胞懸液后，加入1×PBS 5 ml，4℃條件下，1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后，吸棄上清液，加入2.5%的戊二醛溶液固定2 h后，再用1%鋨酸固定液固定2～3 h，1×PBS漂洗3次，4℃條件下，依次用50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，然后用純丙酮+包埋液依次包埋過(guò)夜后，置入烘箱在不同溫度下固化，超薄切片機(jī)切片(50～60 nm)，3%醋酸鈾－硝酸鉛進(jìn)行雙染，透射電鏡JEM－2000EX(日本JEOL公司)觀察、拍片。

1.2.3 A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖檢測(cè)常氧組及乏氧組A549細(xì)胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)24、48、72、96 h，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，予以1×DHank’s漂洗1～2次，再加入150 μl DMSO，將培養(yǎng)板放置在振動(dòng)搖床上緩慢振蕩至甲瓚藍(lán)顆粒完全溶解后，將96孔培養(yǎng)板置入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio－Rad公司)檢測(cè)盒中，于570 nm處測(cè)量各孔的吸光度值(OD)，再以O(shè)D值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 A549細(xì)胞周期檢測(cè)常氧組及乏氧組A549細(xì)胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，4℃條件下，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，重懸細(xì)胞于0.6 ml的1×PBS液，再加入1.4 ml預(yù)冷的75%乙醇混勻后，4℃固定過(guò)夜，上機(jī)前離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于1×PBS液中，50 μg/ml PI溶液37℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。每組設(shè)3個(gè)平行管，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 A549細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

1.2.5.1制備條件培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)A549細(xì)胞，在細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好的情況下?lián)Q無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，過(guò)濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2侵襲能力檢測(cè)分別取50 μl 0.05/L FN，50 μl Matrigel膠均勻包被Transwell小室底部的反面和正面，室溫風(fēng)干;各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化細(xì)胞，將200 μl細(xì)胞懸液接種于上室，細(xì)胞終密度為1× 108/L;下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)基各200 μl，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)共同培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔;置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室;小心擦去微孔濾膜上層的細(xì)胞，固定、染色穿過(guò)微孔濾膜侵襲至下室的細(xì)胞;在200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)，每張膜隨機(jī)選取10個(gè)視野;取各組侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)的平均值，最后按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的侵襲率:細(xì)胞侵襲率(%)=侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)(實(shí)驗(yàn)組)/侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)(常氧組)×100%。

1.2.6 A549細(xì)胞遷徙能力檢測(cè)

1.2.6.1制備條件培養(yǎng)基同1.2.5.1。

1.2.6.2遷徙能力檢測(cè)［5］各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化細(xì)胞，將200 μl細(xì)胞懸液接種于上室，另設(shè)空白組，只加200 μl細(xì)胞培養(yǎng)基而不加細(xì)胞懸液，細(xì)胞終密度為1×109/L;下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)基各200 μl，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)共同培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔;置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，MTT法測(cè)各孔OD值;取各組OD值的平均值，按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的遷徙率:細(xì)胞遷徙率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值)/(對(duì)照組OD值－空白組OD值)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間的均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化光鏡下觀察A549細(xì)胞均貼壁良好，輪廓清晰，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形或圓形，部分細(xì)胞伸出偽足，與常氧組相比，乏氧組未見(jiàn)脫落A549細(xì)胞增多以及大片A549細(xì)胞脫壁的現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。電鏡下觀察A549細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:常氧組及乏氧組A549細(xì)胞切面均成類(lèi)圓形，細(xì)胞膜外有不等量纖毛，細(xì)胞漿內(nèi)線粒體(↓)豐富;與常氧組相比，乏氧組A549細(xì)胞胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)()管腔明顯擴(kuò)張，部分線粒體明顯腫脹，基質(zhì)疏松、嵴斷裂、模糊;可見(jiàn)自噬體()形成，未見(jiàn)明顯凋亡小體。見(jiàn)圖2。

2.2 A549細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖A549細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，結(jié)果顯示:常氧組A549細(xì)胞24 h后即成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，96 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線成S型。乏氧組A549細(xì)胞48 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，72 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線趨于低平。見(jiàn)表1、圖3。

表1　兩組A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況比較(±s)

注:與常氧組比較，aP＜0.05。

組別0 h　24 h　48 h　72 h　96 h常氧組　0.17±0.02 0.47±0.07 0.88±0.17 1.79±0.38　 1.83±0.44乏氧組　0.18±0.02 0.20±0.03a0.36±0.06a0.50±0.09a0.55±0.10a

2.3 A549細(xì)胞周期的影響A549細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示:常氧組與乏氧組A549細(xì)胞均以G1期為主。但乏氧組A549細(xì)胞G1期比例較常氧組增多(P＜0.05); S期比例較常氧組減少(P＜0.05)，G2期比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

2.4 A549細(xì)胞侵襲和遷徙能力的影響在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中，多種物質(zhì)可刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生定向趨化運(yùn)動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用A549細(xì)胞自身分泌的上清液為趨化因子，通過(guò)直接計(jì)數(shù)侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)及侵襲率、MTT比色法測(cè)定微孔濾膜進(jìn)入含趨化因子的下室貼壁細(xì)胞OD間接計(jì)算各組A549細(xì)胞的遷徙率，探討CoCl2化學(xué)乏氧對(duì)A549細(xì)胞侵襲、遷徙能力的影響，結(jié)果顯示:乏氧組A549細(xì)胞侵襲率及遷徙率均較常氧組增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖5、表3。

表2　A549細(xì)胞周期分布(±s，%)

注:與常氧組比較，bP＜0.05。

組別　n　G1期　S期　G2期常氧組3　 48.80±2.48　 36.86±2.13　 12.34±0.55乏氧組　3　 68.67±3.01b　15.67±1.76b14.38±2.39

3　討論

實(shí)體性腫瘤如肺癌、肝癌等常呈失控性生長(zhǎng)，導(dǎo)致瘤內(nèi)低氧。研究表明幾乎所有的實(shí)體腫瘤中均有乏氧細(xì)胞存在，距離功能性血管100～150 μmol/L處即可發(fā)生［6］。目前建立乏氧細(xì)胞模型的方法主要有兩種:一種是在乏氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，即物理乏氧;它可以真實(shí)的反映腫瘤細(xì)胞乏氧微環(huán)境，但是，乏氧培養(yǎng)箱價(jià)格昂貴，從而一定程度上限制其在乏氧實(shí)驗(yàn)中的廣泛開(kāi)展。另一種乏氧方法是常氧條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一些化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)抑制氧信號(hào)的傳導(dǎo)達(dá)到乏氧，即化學(xué)乏氧。其中，CoCl2是在正常氧條件下通過(guò)細(xì)胞內(nèi)離子置換，導(dǎo)致亞鐵螯合酶失活，阻止線粒體產(chǎn)生ATP，使線粒體內(nèi)呼吸障礙，從而達(dá)到細(xì)胞乏氧的目的，與細(xì)胞物理乏氧刺激具有相同的氧感受、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，且具有經(jīng)濟(jì)、方便、無(wú)毒的特點(diǎn)，在低氧研究中被廣泛應(yīng)用［7－8］。

表3　 A549細(xì)胞的侵襲率及遷徙率(±s，%)

注:與常氧組比較，cP＜0.05。

組別　n 侵襲率　　遷徙率常氧組3100±0　100±0乏氧組　3　326±17c　298±42c

既往研究通過(guò)光鏡觀察缺氧時(shí)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺氧可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞體積變小，形態(tài)趨向圓形，似消化過(guò)程中間的細(xì)胞形態(tài)，偽足少且短，折光率減弱、貼壁能力下降等改變［9］。然而，可能受細(xì)胞類(lèi)型、CoCl2干預(yù)濃度及觀察時(shí)間的影響，本實(shí)驗(yàn)化學(xué)乏氧組A549細(xì)胞在光鏡下與常氧對(duì)照組形態(tài)基本一致，貼壁良好，未見(jiàn)脫落細(xì)胞增多以及大片細(xì)胞脫壁等現(xiàn)象，但是電鏡下化學(xué)乏氧組A549細(xì)胞不僅出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，而且出現(xiàn)自噬體。近年來(lái)研究顯示，在缺氧等應(yīng)激存在時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及細(xì)胞自噬對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生存、維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)具有雙重作用。一方面，二者同線粒體一樣，通過(guò)激活caspase－12、caspase－9、caspase－3等，切割多種蛋白質(zhì)底物，引起“瀑布式”的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成凋亡小體，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10－11］;另一方面通過(guò)激活p38SAPK激酶，使腫瘤細(xì)胞處于長(zhǎng)期休眠狀態(tài)［12］，或通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白、細(xì)胞器，合成新的大分子和ATP，減少氧耗，維持乏氧條件下細(xì)胞的存活［13］。本實(shí)驗(yàn)電鏡下乏氧組A549細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)凋亡小體，可能與二者在低濃度(≤200 μmol/L)［14］CoCl2化學(xué)乏氧24 h條件下對(duì)A549細(xì)胞生存起促進(jìn)作用有關(guān)和(或)是其他抗凋亡途徑激活。

除細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT方法觀察CoCl2化學(xué)乏氧對(duì)離體A549細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖的影響，結(jié)果示常氧條件下A549細(xì)胞呈S型曲線迅速生長(zhǎng)，倍增時(shí)間短，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng); CoCl2化學(xué)乏氧條件下，A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線低平，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延遲且短暫，過(guò)早進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)受細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞周期由G1期、S期和G2期3個(gè)階段構(gòu)成，其中G1和G2期的細(xì)胞屬于靜止?fàn)顟B(tài)，而S期的細(xì)胞則屬于增殖狀態(tài)，因此S期的細(xì)胞比例多少可以反映細(xì)胞增殖的速度及生長(zhǎng)的活力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀PI技術(shù)檢測(cè)乏氧對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果示CoCl2化學(xué)乏氧24 h后，A549細(xì)胞G2期比例較常氧對(duì)照組無(wú)明顯差異;但是G1期細(xì)胞較常氧對(duì)照組細(xì)胞逐漸增多，S期細(xì)胞逐漸減少，同吳欣愛(ài)等在食管癌細(xì)胞研究相似［15］。以上研究結(jié)果提示CoCl2化學(xué)乏氧可能通過(guò)誘導(dǎo)G1/S期阻滯抑制A549細(xì)胞增殖。

侵襲性生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別良性腫瘤的重要特征。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤乏氧微環(huán)境是促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素［16］。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中，侵襲、遷徙是必不可少的環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)學(xué)者景紹武、蔣富強(qiáng)等［17－18］研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下，食管癌Eca109細(xì)胞及乳腺癌MCF－7細(xì)胞的侵襲、遷徙能力較常氧組明顯增加。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中，多種物質(zhì)可刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生定向趨化運(yùn)動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用A549細(xì)胞自身分泌的上清液為趨化因子，通過(guò)直接計(jì)數(shù)侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)及侵襲率、MTT比色法測(cè)定微孔濾膜進(jìn)入含趨化因子的下室貼壁細(xì)胞OD值間接計(jì)算各組A549細(xì)胞的遷徙率，結(jié)果示乏氧組人肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲能力及遷徙能力亦較常氧組增強(qiáng)，與胡振紅等［19］研究相似。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用低濃度(≤200 μmol/L)CoCl2建立化學(xué)乏氧環(huán)境，電鏡下發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)自噬體，其G1/S期阻滯，A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖受抑，但A549細(xì)胞侵襲能力及遷徙能力較常氧條件下明顯增強(qiáng)。而其具體機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

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·論著·

Effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells

Li Fang1，Hong Kun2，Huang Li3，Su Xiaoli3，Hu Chengping3
(1.Department of Respiratory and Critical Diseases，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;

2.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang 414000，China;

3.Department of Respiratory and Critical Diseases，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410007，China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells.Methods CoCl2was utilized to establish chemical hypoxia model of human lung adenocarcinoma A549 cells.First，inverted light and electron microscope，MTT assay and flow cytometry were used to observe the effect of CoCl2on the morphology and structure，proliferation and cell cycle of A549 cells.Then，transwell booth model was used to detect the capability of cellular invasion and migration of A549 cells.Results Compared with control group，there were fewer cells and mitochondrial swelling，endoplasmic reticulum expansion and autophagic vacuoles in A549 cells of CoCl2group，with low and flat growth curve，more G1phase cells and less S phase cells，while the ability of migration and invasion were both increased.Conclusion CoCl2induced chemical hypoxia inhibited cell proliferation，induced G1/S arrest，and enhanced the ability of invasion and migration in human lung A549 cell.

【Key words】CoCl2; lung adenocarcinoma; proliferation; invasion; migration

(收稿日期:2015－03－16)

通訊作者:胡成平，E－mail: huchengp28@126.com。

doi:10.3969/j.issn.1004－437X.2015.06.001

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 734.2