劉志剛，劉永芳，胡 剛，謝恒濤

(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，湖北武漢 430060)

胃腸道參與休克及多器官功能不全綜合征(MODS)的病理生理過程，腸缺血再灌注期間胃腸道及遠隔臟器損傷的保護是臨床多學科研究的熱點。其中以急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合癥尤為突出［1－3]。參附注射液 (shenfu injection，SFI)已應用于休克和多器官功能不全綜合征的防治，尤其是胃腸道和肺損傷的保護，近年研究發(fā)現(xiàn)參附注射液可改善油酸所致的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的血流動力學、肺及血液的氧合功能，對肺損傷具有一定的保護和治療作用［4－6]。本研究探討臨床相關等效劑量參附注射液預處理和后處理對腸缺血再灌注損傷所致的急性肺損傷的影響。

1 材料與方法

1．1 藥品和試劑 參附注射液購自吉林卓怡康納制藥有限公司，每支60 mg，批號050301;氯化高鐵血紅素(Hemin)，Sigma公司;兔抗人HO-1多克隆抗體，武漢博士德生物工程公司;免疫組化SABC、SOD、MDA試劑盒(Santa Cruz公司)。

1．2 動物 健康雄性Wistar大鼠56只，體重200～260 g，由武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供(動物許可證號:00012298)。隨機分成7組(n=8)，即對照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、參附注射液預處理組(SFPR組)、參附注射液后處理組(SFPO組)、血晶素組(Hemin組)、鋅原卟啉IX+SFPR組(ZnPPIX+SFPR組)、鋅原卟啉IX+SFPO組。

1．3 方法 實驗前12 h禁食，自由飲水。稱重，10%水合氯醛4 mg·kg－1腹腔麻醉后固定。參照Koji Ito等［7]的方法復制腸I/R模型，腹部正中脫毛，消毒鋪巾，正中切口進腹，分離腸系膜上動脈，在其根部用一個套硅膠管小動脈夾鉗夾，觀察2 min，確定腸系膜上動脈血流被阻斷后，腸壁蒼白，血管無搏動，縫合傷口。1 h后經(jīng)原切口進腹，松開動脈夾，恢復血供。整個手術過程中，于腹腔內(nèi)滴加溫熱37℃生理鹽水維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡。對照組同樣開腹，但不鉗夾血管，僅輕擾腹腔后關腹。各組動物于再灌注2 h后頸動脈放血處死。

1．4 觀察指標與方法

1．4．1 SABC免疫組化方法檢測HO-1蛋白表達 采用免疫組化染色，以肺組織切片細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性細胞。采用HIPAS-2000型全自動圖像分析系統(tǒng)，對HO-1的蛋白表達進行半定量分析，在顯微鏡下對陽性染色進行分析，測定HO-1平均吸光度(OD)，隨機測定5個高倍視野后計算其平均值。

1．4．2 血氣分析測定 大鼠處死前右頸動脈采血1 mL抗凝行血氣分析。按要求將血液填充到與i-STAT血氣分析儀配套的血氣分析測試片加樣池中，避免氣泡產(chǎn)生，將測試片插入自動血氣分析儀，讀取PaO2和PaCO2數(shù)值。

1．4．3 肺通透性指數(shù)測定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度與血清中蛋白濃度之比，即為肺通透性指數(shù)，指數(shù)增大說明肺毛細血管通透性增加，它是評價肺損傷的指標［8]。

采用考馬斯亮蘭蛋白測定法測支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量。

1．4．4 肺組織 MDA、SOD含量測定 取右肺中葉100 mg(濕重)，以硫代巴比妥酸法測MDA，以黃嘌呤氧化酶法測SOD。

1．4．5 分析天平測量肺組織濕/干重比(wet weight to dry weight ratio，W/D) 取左肺部分組織，濾紙吸干表面附著水分，用分析天平準確測量濕重并記錄，于80℃恒溫箱烤24 h至肺干重恒定，稱干重，計算W/D。

1．5 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)以(x±s)示，采用SPSS13．0軟件進行分析，采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 參附注射液對肺組織HO-1表達的影響 與C組比較，I/R組、SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細胞陽性表達增高;與I/R組比較，SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細胞陽性表達增高;ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組上述陽性細胞表達降低(P＜0．05)。見表1。

2．2 參附注射液對肺通透性指數(shù)和肺組織MDA、SOD含量的影響 I/R組肺通透性指數(shù)與肺組織MDA含量明顯高于C組，而SOD含量顯著降低(P＜0．05);與I/R組比較，SFPR組、SFPO組和Heim組肺通透性指數(shù)、肺組織MDA含量均顯著降低，SOD 值明顯升高(P ＜0．05或 P ＜0．01)，ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

2．3 參附注射液對大鼠肺組織濕/干重比的影響與C組相比，I/R組肺組織濕/干重比增高50%(P＜0．05)，SFPR組、SFPO組和Heim組較I/R組分別降低17．4%、13．4% 和 18．6%(P ＜ 0．05)，但仍高于 C組(P＜0．05);ZnPPIX+SFPR組和 Zn-PPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表2。

表1 參附注射液對肺組織HO-1(OD)和MDA、SOD含量表達的影響(x ± s，n=8)

表2 參附注射液對肺通透性指數(shù)和肺組織濕/干重比的影響(x ± s，n=8)

2．4 參附注射液對動脈血氣的影響 各組動物動脈血pH值相近，無顯著統(tǒng)計學意義。大鼠缺血再灌注后，PaO2、PaCO2較 C 組顯著下降(P ＜0．05)。SFPR組、SFPO組和Heim組PaO2、PaCO2明顯高于I/R組，ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表3。

3 討論

腸缺血/再灌注損傷是臨床上一種很常見且非常重要的臨床現(xiàn)象，研究表明，腸缺血再灌注損傷不僅加重腸道損傷，而且造成腸外多種器官損傷，如肺、心、腎、肝功能受損，甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是最易受損的器官，急性肺損傷(ALI)是MODS發(fā)展中出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高的臨床癥狀，嚴重時可發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［9－10]。所以腸缺血再灌注引起的急性肺損傷倍受關注。

表3 各組大鼠動脈血氣分析比較(x ± s，n=8)

本實驗證實了大鼠腸缺血1 h再灌注2 h可引起典型的急性肺損傷病理表現(xiàn)。文獻報道［11－13]，腸缺血再灌注后，氧自由基造成的損害可能為重要的病理機制，并在腸缺血再灌注后的肺損傷中起重要作用;本研究的結(jié)果與之一致，腸缺血再灌注后，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增高，與對照組相比差異非常顯著，提示腸缺血再灌注后產(chǎn)生的氧自由基對肺血管內(nèi)皮和肺泡細胞膜產(chǎn)生了明顯損傷。

參附注射液作為一種傳統(tǒng)的中藥，具有穩(wěn)定的強心升壓作用，改善微循環(huán)，防治臟器缺血—再灌注損傷，主要應用于創(chuàng)傷、休克及危重病患者的急救;參附采用10 mL·kg－1是根據(jù)臨床使用后換算而來的相關劑量［14－15]。

本研究發(fā)現(xiàn):缺血再灌注組肺內(nèi)組織HO-1表達增加，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，氧和指數(shù)顯著降低，肺組織出現(xiàn)典型的病理特征;當預防性的給予臨床相關劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導劑血晶素(Hemin)時，肺內(nèi) HO-1表達均明顯增強，肺組織中MDA含量相應降低，而SOD活性顯著增高，肺氧和指數(shù)明顯改善。組織病理學改變減輕:肺組織病理變化在參附注射液預防組僅見部分肺泡及血管壁周圍淋巴細胞浸潤，損傷程度較缺血再灌注組明顯減輕。結(jié)果表明預防性應用臨床相關劑量的參附注射液對腸缺血再灌注導致的急性肺損傷有明顯的保護作用，當腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時，盡管在缺血前預防性的給予臨床相關劑量的參附注射液，但各項指標與I/R組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，其保護作用不再呈現(xiàn)。提示SFI預處理對IIR肺損傷的保護作用可能與誘導HO-1的肺內(nèi)高表達有關。

本研究還發(fā)現(xiàn):當治療性的給予臨床相關劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導劑血晶素(Hemin)時，肺內(nèi)HO-1表達明顯增強，肺組織中MDA含量相應降低，而SOD活性顯著增高，肺氧合指數(shù)明顯改善。組織病理學改變減輕，結(jié)果表明治療性應用臨床相關劑量的參附注射液對腸缺血再灌注導致的急性肺損傷也有明顯的保護作用，當腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時，盡管在再灌注前治療性的給予臨床相關劑量的參附注射液，但各項指標與I/R組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，其保護作用不再呈現(xiàn)。提示SFI后處理對IIR肺損傷的保護作用也可能與誘導HO-1的肺內(nèi)高表達有關。

因此，臨床相關劑量的參附注射液預處理和后處理均減輕了肺組織的病理損傷，從而改善肺功能，提高機體氧輸送能力，改善機體缺氧狀態(tài)，有著廣闊的臨床應用前景和實用價值。其共同機制可能與上調(diào)HO-1蛋白表達、一定程度上抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗氧自由基的損傷有關，但其保護作用的確切機制尚需進一步研究。

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