劉志剛,劉永芳,胡 剛,謝恒濤
(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,湖北武漢 430060)
胃腸道參與休克及多器官功能不全綜合征(MODS)的病理生理過程,腸缺血再灌注期間胃腸道及遠(yuǎn)隔臟器損傷的保護(hù)是臨床多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。其中以急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合癥尤為突出[1-3]。參附注射液 (shenfu injection,SFI)已應(yīng)用于休克和多器官功能不全綜合征的防治,尤其是胃腸道和肺損傷的保護(hù),近年研究發(fā)現(xiàn)參附注射液可改善油酸所致的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的血流動(dòng)力學(xué)、肺及血液的氧合功能,對(duì)肺損傷具有一定的保護(hù)和治療作用[4-6]。本研究探討臨床相關(guān)等效劑量參附注射液預(yù)處理和后處理對(duì)腸缺血再灌注損傷所致的急性肺損傷的影響。
1.1 藥品和試劑 參附注射液購(gòu)自吉林卓怡康納制藥有限公司,每支60 mg,批號(hào)050301;氯化高鐵血紅素(Hemin),Sigma公司;兔抗人HO-1多克隆抗體,武漢博士德生物工程公司;免疫組化SABC、SOD、MDA試劑盒(Santa Cruz公司)。
1.2 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠56只,體重200~260 g,由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):00012298)。隨機(jī)分成7組(n=8),即對(duì)照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、參附注射液預(yù)處理組(SFPR組)、參附注射液后處理組(SFPO組)、血晶素組(Hemin組)、鋅原卟啉IX+SFPR組(ZnPPIX+SFPR組)、鋅原卟啉IX+SFPO組。
1.3 方法 實(shí)驗(yàn)前12 h禁食,自由飲水。稱重,10%水合氯醛4 mg·kg-1腹腔麻醉后固定。參照Koji Ito等[7]的方法復(fù)制腸I/R模型,腹部正中脫毛,消毒鋪巾,正中切口進(jìn)腹,分離腸系膜上動(dòng)脈,在其根部用一個(gè)套硅膠管小動(dòng)脈夾鉗夾,觀察2 min,確定腸系膜上動(dòng)脈血流被阻斷后,腸壁蒼白,血管無搏動(dòng),縫合傷口。1 h后經(jīng)原切口進(jìn)腹,松開動(dòng)脈夾,恢復(fù)血供。整個(gè)手術(shù)過程中,于腹腔內(nèi)滴加溫?zé)?7℃生理鹽水維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡。對(duì)照組同樣開腹,但不鉗夾血管,僅輕擾腹腔后關(guān)腹。各組動(dòng)物于再灌注2 h后頸動(dòng)脈放血處死。
1.4.1 SABC免疫組化方法檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá) 采用免疫組化染色,以肺組織切片細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀物為陽(yáng)性細(xì)胞。采用HIPAS-2000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng),對(duì)HO-1的蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析,在顯微鏡下對(duì)陽(yáng)性染色進(jìn)行分析,測(cè)定HO-1平均吸光度(OD),隨機(jī)測(cè)定5個(gè)高倍視野后計(jì)算其平均值。
1.4.2 血?dú)夥治鰷y(cè)定 大鼠處死前右頸動(dòng)脈采血1 mL抗凝行血?dú)夥治?。按要求將血液填充到與i-STAT血?dú)夥治鰞x配套的血?dú)夥治鰷y(cè)試片加樣池中,避免氣泡產(chǎn)生,將測(cè)試片插入自動(dòng)血?dú)夥治鰞x,讀取PaO2和PaCO2數(shù)值。
1.4.3 肺通透性指數(shù)測(cè)定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度與血清中蛋白濃度之比,即為肺通透性指數(shù),指數(shù)增大說明肺毛細(xì)血管通透性增加,它是評(píng)價(jià)肺損傷的指標(biāo)[8]。
采用考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定法測(cè)支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量。
1.4.4 肺組織 MDA、SOD含量測(cè)定 取右肺中葉100 mg(濕重),以硫代巴比妥酸法測(cè)MDA,以黃嘌呤氧化酶法測(cè)SOD。
1.4.5 分析天平測(cè)量肺組織濕/干重比(wet weight to dry weight ratio,W/D) 取左肺部分組織,濾紙吸干表面附著水分,用分析天平準(zhǔn)確測(cè)量濕重并記錄,于80℃恒溫箱烤24 h至肺干重恒定,稱干重,計(jì)算W/D。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x±s)示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,采用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 參附注射液對(duì)肺組織HO-1表達(dá)的影響 與C組比較,I/R組、SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)增高;與I/R組比較,SFPR組、SFPO組和Heim組肺組織HO-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)增高;ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組上述陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05)。見表1。
2.2 參附注射液對(duì)肺通透性指數(shù)和肺組織MDA、SOD含量的影響 I/R組肺通透性指數(shù)與肺組織MDA含量明顯高于C組,而SOD含量顯著降低(P<0.05);與I/R組比較,SFPR組、SFPO組和Heim組肺通透性指數(shù)、肺組織MDA含量均顯著降低,SOD 值明顯升高(P <0.05或 P <0.01),ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
2.3 參附注射液對(duì)大鼠肺組織濕/干重比的影響與C組相比,I/R組肺組織濕/干重比增高50%(P<0.05),SFPR組、SFPO組和Heim組較I/R組分別降低17.4%、13.4% 和 18.6%(P < 0.05),但仍高于 C組(P<0.05);ZnPPIX+SFPR組和 Zn-PPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表1 參附注射液對(duì)肺組織HO-1(OD)和MDA、SOD含量表達(dá)的影響(x ± s,n=8)
表2 參附注射液對(duì)肺通透性指數(shù)和肺組織濕/干重比的影響(x ± s,n=8)
2.4 參附注射液對(duì)動(dòng)脈血?dú)獾挠绊?各組動(dòng)物動(dòng)脈血pH值相近,無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠缺血再灌注后,PaO2、PaCO2較 C 組顯著下降(P <0.05)。SFPR組、SFPO組和Heim組PaO2、PaCO2明顯高于I/R組,ZnPPIX+SFPR組和ZnPPIX+SFPO組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
腸缺血/再灌注損傷是臨床上一種很常見且非常重要的臨床現(xiàn)象,研究表明,腸缺血再灌注損傷不僅加重腸道損傷,而且造成腸外多種器官損傷,如肺、心、腎、肝功能受損,甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是最易受損的器官,急性肺損傷(ALI)是MODS發(fā)展中出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高的臨床癥狀,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[9-10]。所以腸缺血再灌注引起的急性肺損傷倍受關(guān)注。
表3 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^(x ± s,n=8)
本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠腸缺血1 h再灌注2 h可引起典型的急性肺損傷病理表現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道[11-13],腸缺血再灌注后,氧自由基造成的損害可能為重要的病理機(jī)制,并在腸缺血再灌注后的肺損傷中起重要作用;本研究的結(jié)果與之一致,腸缺血再灌注后,肺組織中SOD活性明顯降低,MDA含量顯著增高,與對(duì)照組相比差異非常顯著,提示腸缺血再灌注后產(chǎn)生的氧自由基對(duì)肺血管內(nèi)皮和肺泡細(xì)胞膜產(chǎn)生了明顯損傷。
參附注射液作為一種傳統(tǒng)的中藥,具有穩(wěn)定的強(qiáng)心升壓作用,改善微循環(huán),防治臟器缺血—再灌注損傷,主要應(yīng)用于創(chuàng)傷、休克及危重病患者的急救;參附采用10 mL·kg-1是根據(jù)臨床使用后換算而來的相關(guān)劑量[14-15]。
本研究發(fā)現(xiàn):缺血再灌注組肺內(nèi)組織HO-1表達(dá)增加,肺組織中SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高,氧和指數(shù)顯著降低,肺組織出現(xiàn)典型的病理特征;當(dāng)預(yù)防性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導(dǎo)劑血晶素(Hemin)時(shí),肺內(nèi) HO-1表達(dá)均明顯增強(qiáng),肺組織中MDA含量相應(yīng)降低,而SOD活性顯著增高,肺氧和指數(shù)明顯改善。組織病理學(xué)改變減輕:肺組織病理變化在參附注射液預(yù)防組僅見部分肺泡及血管壁周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),損傷程度較缺血再灌注組明顯減輕。結(jié)果表明預(yù)防性應(yīng)用臨床相關(guān)劑量的參附注射液對(duì)腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷有明顯的保護(hù)作用,當(dāng)腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時(shí),盡管在缺血前預(yù)防性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液,但各項(xiàng)指標(biāo)與I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其保護(hù)作用不再呈現(xiàn)。提示SFI預(yù)處理對(duì)IIR肺損傷的保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)HO-1的肺內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。
本研究還發(fā)現(xiàn):當(dāng)治療性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導(dǎo)劑血晶素(Hemin)時(shí),肺內(nèi)HO-1表達(dá)明顯增強(qiáng),肺組織中MDA含量相應(yīng)降低,而SOD活性顯著增高,肺氧合指數(shù)明顯改善。組織病理學(xué)改變減輕,結(jié)果表明治療性應(yīng)用臨床相關(guān)劑量的參附注射液對(duì)腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷也有明顯的保護(hù)作用,當(dāng)腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX(ZnPPIX)時(shí),盡管在再灌注前治療性的給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液,但各項(xiàng)指標(biāo)與I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其保護(hù)作用不再呈現(xiàn)。提示SFI后處理對(duì)IIR肺損傷的保護(hù)作用也可能與誘導(dǎo)HO-1的肺內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。
因此,臨床相關(guān)劑量的參附注射液預(yù)處理和后處理均減輕了肺組織的病理?yè)p傷,從而改善肺功能,提高機(jī)體氧輸送能力,改善機(jī)體缺氧狀態(tài),有著廣闊的臨床應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。其共同機(jī)制可能與上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)、一定程度上抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗氧自由基的損傷有關(guān),但其保護(hù)作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
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