曾 澤，岳 華，馮曉輝，何 歡，張 斌

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041)

rfaE基因在副豬嗜血桿菌LOS刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄中的作用

曾 澤，岳 華，馮曉輝，何 歡，張 斌*

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041)

為研究rfaE基因在副豬嗜血桿菌(HPS)脂寡糖(LOS)刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA轉(zhuǎn)錄中的作用，提取HPS SC096株及其rfaE基因缺失株(ΔrfaE)和互補(bǔ)株(cΔrfaE)的LOS，分別用5和10 μg HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs，分別在2、4、6、12和24 h后收集細(xì)胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明用5 μg HPS-LOS刺激細(xì)胞時(shí)，2、4、6、12和24 h后IL-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均升高，顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后的IL-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，12和24 h后IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均升高，顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，24 h后TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平升高，顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)；10 μg HPS-LOS刺激細(xì)胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均升高，顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。同時(shí)cΔrfaE-LOS刺激PAMs后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平能夠恢復(fù)到HPS-LPS水平。首次證實(shí)rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平中起著重要的作用。

副豬嗜血桿菌；rfaE基因；脂寡糖；炎性因子；mRNA轉(zhuǎn)錄水平

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種共棲菌，可以在特定的條件下侵入宿主體內(nèi)引起以豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的全身性疾病[1-2]。在HPS中，脂寡糖(LOS)被證實(shí)參與HPS的致病過程，是一個(gè)重要的毒力因子，同時(shí)LOS還能刺激宿主細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生，但是哪些成分參與了這個(gè)過程還不清楚[3-5]。在革蘭陰性菌中，rfaE基因編碼的ADP-L-甘油-D-甘露庚糖參與核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成[6-7]。在HPS中，缺失rfaE基因?qū)е录?xì)菌生長(zhǎng)速度變慢，降低細(xì)菌抗血清殺菌作用和對(duì)細(xì)胞黏附入侵能力，同時(shí)還導(dǎo)致細(xì)菌LOS的糖鏈變短[8]。上述結(jié)果表明缺失rfaE基因后可能影響LOS核心多糖的合成，從而降低細(xì)菌的致病性。為了研究rfaE基因在 HPS LOS刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA轉(zhuǎn)錄中的作用，作者運(yùn)用Real-Time PCR方法檢測(cè)HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS刺激PAMs炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以確定rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子轉(zhuǎn)錄水平中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種、細(xì)胞

所用HPS SC096菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，HPS的rfaE基因缺失株(ΔrfaE)及其互補(bǔ)株(cΔrfaE)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[9]，PAMs購(gòu)自ATCC公司。

1.2 主要試劑

TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)購(gòu)自青島海博試劑有限公司；新生牛血清購(gòu)自鄭州佰安生物工程有限公司；NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，大腸桿菌(Escherichiacoli)O55：B5的LPS購(gòu)自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；PrimeScriptTMRT 試劑盒、SYBR premix Ex TaqTM、TaqDNA聚合酶、Trizol等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器

7300 Real-Time PCR System購(gòu)自 Applied Biosystems公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司。

1.4 LOS的提取及質(zhì)量濃度的測(cè)定

將-80 ℃凍存的HPS SC096菌株及ΔrfaE和cΔrfaE在制備好的TSA(含新生牛血清和NAD)平板上復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。然后挑取單菌落在TSB(含新生牛血清和NAD)肉湯中于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)8～12 h。通過熱酚法[9]提取LOS，采用蒽酮法[10]測(cè)定所提LOS的質(zhì)量濃度。

1.5 豬肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

在12孔板上用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)PAMs。用5和10 μg不同劑量的HPS SC096菌株、ΔrfaE和cΔrfaE的LOS，E.coli的LPS刺激PAMs，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，每種處理細(xì)胞的方法設(shè)置3個(gè)平行，在2、4、6、12和24 h后收集細(xì)胞。

1.6 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

加入Trizol收集PAMs，提取細(xì)胞總RNA，溶于20 μL DEPC處理水，用于合成cDNA。 利用PrimeScriptTMRT 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于-20 ℃待用。

1.7 Real-Time PCR

RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，SYBR premix Ex TaqTM10 μL，引物F/R均為0.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 31 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，同時(shí)設(shè)定不加cDNA的陰性對(duì)照，檢測(cè)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。由于用LPS刺激PAMs后核糖體蛋白L4(RPL4)的mRNA能夠穩(wěn)定表達(dá)，所以選取RPL4作為管家基因[11]。引物序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 炎性因子及管家基因引物序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

參照K.J.Livak等[13]的介紹，不同組別中各炎性因子含量通過2-ΔΔCT法進(jìn)行比較，所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 提取的LOS質(zhì)量濃度的測(cè)定

用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品利用蒽酮法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定所抽提的LOS質(zhì)量濃度如下：HPS-LOS質(zhì)量濃度為491.2 μg·mL-1，ΔrfaE-LOS質(zhì)量濃度為452.1 μg·mL-1，cΔrfaE-LOS質(zhì)量濃度為537.3 μg·mL-1。

2.2 RT-PCR檢測(cè)LPS對(duì)PAMs 炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

以E.coli-LPS為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，用5和10 μg不同劑量的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS刺激PAMs，用RT-PCR檢測(cè)2、4、6、12和24 h后炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

用5 μg 的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs細(xì)胞2、4、6、12和24 h后對(duì)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞6、12和24 h后IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(圖1)，而且顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞12和24 h后IL-1β和IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞12和24 h后IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.001)，IL-1β，IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24 h后升高到最大分別為2.5倍，4.5倍和7.5倍。而IL-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在HPS-LOS，cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞2、4、6、12和24 h后都升高，而且顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后IL-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，IL-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24 h后升高到最大2.4倍。

*代表與野生型SC096的LOS刺激組相比差異顯著(P<0.05)；**代表與野生型SC096的LOS刺激組相比差異極顯著(P<0.001)。圖2同* represent significant difference (P<0.05) when compared with the stimulated group of LOS from wild type SC096；** represent extremely significant difference (P<0.001) when compared with the stimulated group of LOS from wild type SC096.The same as below圖1 5 μg LOS刺激PAMs 后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.1 The mRNA transcription level change of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α after 5 μg LOS stimulated PAMs

用10 μg的 HPS-LOS，ΔrfaE-LOS，cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs細(xì)胞2、4、6、12和24 h后對(duì)IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞4、6、12和24 h后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的升高(圖2)，而且顯著高于ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。用10 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于5 μg的HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，但是用5 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞24 h后TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高7.5倍，10 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞12 h后TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高卻只有4.7倍。

3 討 論

HPS是危害養(yǎng)豬業(yè)一個(gè)重要的細(xì)菌性病原，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在HPS中，LOS被證實(shí)是HPS中一個(gè)重要的毒力因子，參與了細(xì)菌的致病過程[3-5]。在革蘭陰性菌中，用一定量的LOS刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，LOS被Toll樣受體4(TLR4)和伴侶分子MD-2識(shí)別，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化多種轉(zhuǎn)錄因子，從而合成并釋放IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子，再通過旁分泌或體循環(huán)作用于其他組織細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)[9，14-15]。PAMs能夠分泌和釋放多種炎性因子，并募集和趨化中性粒細(xì)胞等其他類型炎癥性細(xì)胞到達(dá)肺泡間隙，在肺部急性炎癥中發(fā)揮重要作用[16-17]。激活的PAMs能夠產(chǎn)生一種內(nèi)源性炎性因子TNF-α，它是一種具有廣泛重要生物學(xué)作用的蛋白質(zhì)，同時(shí)PAMs還能分泌IL-1，當(dāng)IL-1的分泌量過高時(shí)可以刺激各種免疫細(xì)胞及炎性細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6和IL-8等多種炎性因子，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)和細(xì)胞損傷。

圖2 10 μg LOS刺激PAMs 后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.2 The mRNA transcription level change of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α after 10 μg LOS stimulated PAMs

在HPS中，外膜蛋白P2(OmpP2)和LOS均能刺激細(xì)胞釋放IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子[4-5，12]。本試驗(yàn)利用提取的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS來(lái)研究其刺激PAMs的炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，證實(shí)rfaE基因在LOS致病過程中的作用，研究結(jié)果表明HPS缺失掉rfaE基因后的LOS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力明顯降低。在鼠傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和大腸桿菌中，缺失了rfaE基因均會(huì)導(dǎo)致LOS糖鏈的變短。本團(tuán)隊(duì)[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HPS缺失rfaE基因不僅導(dǎo)致細(xì)菌LOS的糖鏈變短，而且還導(dǎo)致了細(xì)菌生長(zhǎng)速度變慢，降低了細(xì)菌抗血清殺菌作用和對(duì)細(xì)胞黏附入侵能力。rfaE基因編碼的ADP-L-甘油-D-甘露庚糖參與了核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成，推斷缺失了HPSrfaE基因核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成受阻導(dǎo)致了LOS糖鏈變短，這可能降低了LOS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力。另外，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，而ΔrfaE-LOS刺激細(xì)胞釋放IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的能力明顯降低，為HPS新型疫苗的研制開辟了新的途徑。

4 結(jié) 論

ΔrfaE-LOS刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，首次證實(shí)rfaE基因在HPS LOS誘導(dǎo)炎性因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平中起著重要的作用，為研究rfaE基因在LOS誘導(dǎo)細(xì)胞致炎作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

The Effect ofrfaEGene inHaemophilusparasuisLOS Induces Pro-inflammatory Cytokine mRNA Transcription in Porcine Alveolar Macrophages

ZENG Ze，YUE Hua，F(xiàn)ENG Xiao-hui，HE Huan，ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

The aim of this study was to study the role ofrfaEgene ofHaemophilusparasuislipooligosaccharide (LOS) which induced pro-inflammatory cytokine (interleukin (IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and tumor necrosis factor (TNF)-α) mRNA transcription in porcine alveolar macrophages (PAMs).The LOS ofH.parasuisSC096 strain，rfaEmutant and its complementation was extracted.The PAMs were stimulated with LOS (5 μg and 10 μg) fromH.parasuisSC096，ΔrfaEmutant (ΔrfaE) and its complementation (cΔrfaE) and LPS fromEscherichiacolifor 2，4，6，12 and 24 h.The RNA was extracted and reversed into cDNA.The mRNA transcription of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α were then detected by Real-time PCR.The result showed that the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 2，4，6，12 and 24 h were up-regulated，and significantly higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)， the mRNA transcription of IL-1β，IL-6，IL-8 in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 12 and 24 h were up-regulated，and remarkably higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)，the mRNA transcription of TNF-α in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 24 h was up-regulated，and notably higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)；the 10 μg LOS fromH.parasuisup-regulated mRNA transcription of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in PAMs，and were significantly higher than that of 10 μg LOS from ΔrfaEmutant (P<0.05).At the same time，the cytokine mRNA transcription levels in PAMs induced by LOS fromcΔrfaEwere restored to the level in PAMs induced by LOS fromH.parasuis.The date firstly confirmed that therfaEgene were involved in the pro-inflammatory cytokine mRNA transcription in PAMs induced byH.parasuisLOS，suggesting that therfaEgene play an important role in the pathogenesis ofH.parasuisLOS.

Haemophilusparasuis；rfaEgene；lipooligosaccharide；pro-inflammatory cytokine；mRNA transcription level

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.021

2014-10-11

“十二五”國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃 (2012AA101304)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31302119)；四川省教育廳項(xiàng)目(14ZB046)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2014SZ94)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303034-1)

曾 澤(1991-)，女，貴州畢節(jié)人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究，E-mail: 839017291@qq.com

*通信作者：張 斌，副研究員，E-mail: binovy@sina.com

S852.613

A

0366-6964(2015)07-1232-06