趙 莉，石保新，李 軍，張壯志，馬正海，張 旭，薛 晶，金映紅，張文寶*

(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆大學生命科學與技術學院重點實驗室，烏魯木齊 830046；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心，新疆包蟲病基礎醫(yī)學重點實驗室，烏魯木齊 830054)

細粒棘球蚴原頭蚴包囊和原頭蚴成蟲抑制差減雜交文庫中差異表達基因的篩選及分析

趙 莉1#，石保新1#，李 軍3，張壯志1，馬正海2，張 旭1，薛 晶1，金映紅1，張文寶3*

(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000；2.新疆大學生命科學與技術學院重點實驗室，烏魯木齊 830046；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心，新疆包蟲病基礎醫(yī)學重點實驗室，烏魯木齊 830054)

細粒棘球絳蟲原頭蚴(PSC)具有雙向發(fā)育的特點，本文旨在利用SSH和生物信息學方法篩選原頭蚴包囊(CW)和成蟲(AW)特異性的基因。將PSC-CW和PSC-AW雙相發(fā)育差減cDNA文庫的差減PCR產物克隆入pGEM-T載體并測序，利用CAP3 sequence assembly在線軟件、Blast2GO軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫對測序結果進行分析，篩選原頭蚴成囊和成蟲特異性的基因，并探討這些基因的功能。結果顯示：對PSC-CW和PSC-AW文庫進行擴增，分別得到280和200個陽性克隆，菌落PCR鑒定結果表明，這些克隆均插入200～1 000 bp片段。測序結果顯示從PSC-CW和PSC-AW SSH文庫中分別得到16和10個特異性基因。其中PSC-CW SSH文庫中得到4個出現(xiàn)頻率較高的基因，其余12個基因僅出現(xiàn)1次，其中5個為未知基因，已知基因分別編碼細胞色素C氧化酶I、熱休克蛋白70和鐵蛋白等功能蛋白質。PSC-AW SSH文庫中得到10個基因，其中2個出現(xiàn)頻率較高基因，8個基因僅出現(xiàn)1次，4個為未知基因，6個已知基因分別編碼基質蛋白1、延伸因子1α和脂肪酸結合蛋白等功能蛋白質。本研究篩選獲得原頭蚴成囊和成蟲發(fā)育時差異表達的基因，對這些基因的功能進行分析表明，PSC-CW SSH文庫中多是與營養(yǎng)和能量轉運功能的相關基因，而PSC-AW SSH文庫中多為發(fā)育與分化相關的基因，這些基因的差異表達可能與原頭蚴處于不同的生長環(huán)境和發(fā)育方向有關，同時也為棘球蚴病免疫診斷、藥物篩選和疫苗研制提供候選基因。

細粒棘球絳蟲；抑制差減雜交；特異性基因

細粒棘球蚴病，又稱為包蟲病，是由細粒棘球絳蟲引起的一種嚴重的人畜共患病[1]。細粒棘球絳蟲原頭蚴具有獨特的雙向性發(fā)育的能力，可以在中間宿主體內發(fā)育為包囊，進而完成生活史的無性繁殖(繼發(fā)性感染)，若中間宿主帶包囊的臟器被終末宿主(犬等)采食，原頭蚴在犬小腸中發(fā)育為細粒棘球絳蟲成蟲，這又構成了原頭蚴有性繁殖(圖1)，若能尋找到相關的特異性基因，就可以切斷其循環(huán)史。隨著分子生物學技術的發(fā)展和對寄生蟲蟲體發(fā)育學的深入認識，人們可以篩選出在蟲體不同發(fā)育階段特異性表達的基因，以研究這些基因在細胞分化過程中的作用及相互關系，為寄生蟲病的免疫診斷、藥物篩選和疫苗研制提供候選基因。抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是一種高效鑒定和克隆差異表達基因的新技術[2]。SSH在許多方面具有其獨特的優(yōu)越性：該方法操作簡便、周期短，且陽性率高，達94%以上[3]，有利于快速建立基因表達圖譜，從整體上了解生物(細胞)在特定時期或特定環(huán)境下的基因表達動態(tài)；該方法靈敏度高，可使低豐度的mRNA得以高于1 000倍的富集，較其他方法更易于在轉錄水平上研究特定細胞或組織的基因表達差異[4]。本研究利用細粒棘球絳蟲生長發(fā)育的特殊生物學特點，以幼蟲(原頭蚴)雙相發(fā)育為切入點。利用SSH分離原頭蚴特異的成囊及成蟲基因，并結合生物信息學(bioinformatics)技術對獲得基因進行分析，以篩查細粒棘球蚴雙相發(fā)育相關基因，為研究細粒棘球蚴雙相發(fā)育現(xiàn)象奠定基礎。

圖1 細粒棘球絳蟲原頭蚴的雙相發(fā)育Fig.1 Bidirectional development of the protoscolex of E.granulosus

1 材料與方法

試驗于2009—2010年在新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所完成。

1.1 SSH文庫

1.1.1 PSC-CW SSH文庫 以細粒棘球絳蟲原頭蚴為驅動相，包囊為實驗相，構建的原頭蚴包囊抑制差減雜交文庫，由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所寄生蟲研究室提供。

1.1.2 PSC-AW SSH文庫 以細粒棘球絳蟲原頭蚴為驅動相，成蟲為實驗相，構建的原頭蚴成蟲抑制差減雜交文庫，由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所寄生蟲研究室提供。

1.2 菌種和質粒

pGEM-T easy vector購自Promega公司；pMAL-p2x載體由本室保存，大腸桿菌DH5α和BL21由本室保存。其他試劑均為國產分析純產品。

1.3 生化及分子生物學試劑

PCR 片段回收試劑盒，膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、DNA marker、T4DNA 連接酶、限制性內切酶購自TaKaRa公司；硝酸纖維素膜及3 mm濾紙均為德國 Whatman 公司產品；其余常規(guī)試劑為國產分析純試劑。

1.4 引物設計與合成

根據(jù)pGEM T easy vecter載體序列合成以下引物，T7 primer：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；M13 reverse primer：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′，引物由上海生工公司合成。

1.5 目的片段與載體的連接反應

將原頭蚴包囊和原頭蚴成蟲的SSH文庫的PCR產物與pGEM T載體于T4DNA連接酶作用下，4 ℃連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂在含Amp+(75 μg·mL-1)瓊脂平板上，37 ℃，正置20 min后，倒置培養(yǎng)過夜。

1.6 SSH文庫的鑒定

用牙簽挑取單菌落接入少量LB培養(yǎng)基(Amp+)中，搖床振蕩培養(yǎng)過夜，取少量細菌為模板進行PCR擴增。PCR擴增參數(shù)：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。在0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物后，用DNA凝膠回收試劑盒對PCR產物進行切膠純化。

1.7 SSH文庫測序與序列分析

將菌落PCR擴增片段在200～1 000 bp的克隆分別挑選100個克隆送上海博尚生物有限公司進行測序。PSC-CW和PSC-AW SSH文庫測序成功的序列分別為86和80個序列。將測序結果去除載體和引物序列以后，首先利用CAP3 sequence assembly在線軟件對序列的正反向進行比對，獲得高表達基因和單一基因，然后利用BLAST2GO在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析和已知序列在生物學過程、分子功能和細胞組分方面所具有的功能。

2 結 果

2.1 消減文庫插入片段的PCR鑒定

將PSC-CW和PSC-AW文庫的PCR產物分別插入pGEM-T easy vector，轉化DH5α感受態(tài)細胞，分別得到280和200個陽性克隆，以pGEM- T easy vecter通用引物進行菌落PCR擴增，均能擴增出大小不等的插入片段，電泳結果顯示插入片段大小主要分布在 200～1 000 bp，這些條帶可能代表差異表達的基因片段 (圖2、3)。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1～46.cDNA插入片段的PCR產物M.DNA marker DL2000；1-46.The PCR products of cDNA inserts圖2 PSC-CW SSH文庫的部分PCR擴增結果Fig.2 PCR analysis of the PSC-CW SSH library

2.2 PSC-CW文庫的cDNA測序與序列分析初步結果

2.2.1 序列同源性比較 將文庫送至上海博尚生物有限公司，進行全文庫單向測序。利用CAP3 sequence assembly在線軟件進行正反向序列分析，結果顯示，共獲得16個基因，其中有4個為出現(xiàn)頻率較多基因，12個基因僅出現(xiàn)1次，用Blast2GO在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，結果顯示11個基因是已知基因，5個未知基因，PSC-CW文庫測序結果見表1。

表1 文庫中擴增基因的分析

M.DL2000 DNA相對分子質量標準；1～46.cDNA插入片段的PCR產物M.DNA marker DL2000；1-46.The PCR products of cDNA inserts圖3 PSC-AW 文庫的部分PCR擴增結果Fig.3 PCR analysis of the PSC-AW SSH library

2.2.2 功能分析 對差異表達基因編碼的蛋白質按照生物學過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)水平進行功能分類分析。按生物學過程水平分析(圖4)，其功能主要涉及細胞分化和凋亡(GO：0009987)、細胞內大分子等物質代謝(GO：0008152)、蛋白轉運與定位(GO：0051179)、電子傳遞及細胞內環(huán)境調節(jié)(GO：0065007)、應激反應(GO：0050896)以及編碼細胞構成成分(GO：0016043)等。在分子功能水平分析(圖5)，它們主要具有核苷酸、陰離子、血紅素等的結合能力(GO：0005488)、氧化還原酶類的催化活性(GO：0003824)、核糖體的組成成分(GO：0005198)、基質跨膜轉運活性(GO：0005215)和氫、鐵等離子載體活性(GO：0009055)等功能。按照細胞組分水平分析(圖6)，這些基因編碼蛋白能夠構成細胞膜(GO：0005623)、線粒體、細胞質等器官(GO：0043226)和細胞復雜的大分子物質等(GO：0032991)。

2.3 PSC-AW文庫的cDNA測序與序列分析初步結果

圖4 基于生物學過程水平對PSC-CW文庫序列進行分析Fig.4 The analysis of the clone of the PSC-CW SSH library at biological process level

圖5 基于分子功能水平對PSC-CW文庫序列的分析Fig.5 The analysis of the clone of the PSC-CW SSH library at molecular function level

2.3.1 序列同源性比較 將文庫送至上海博尚生物有限公司，進行全文庫單向測序掃描。根據(jù)CAP3 sequence assembly在線軟件進行正反向序列分析，結果顯示，共獲得10個基因，其中2個為出現(xiàn)頻率較多的基因，8個基因僅出現(xiàn)1次，用Blast2GO在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，結果顯示6個基因是已知基因，4個未知基因，PSC-AW文庫測序結果列于表1。

2.3.2 功能分析 將上述已知序列在生物過程水平上進行分析(圖7)，其編碼的蛋白質涉及細胞大分子物質的合成等生物合成過程(GO：0009987)，細胞內大分子、蛋白質等的代謝過程(GO：0008152)，細胞營養(yǎng)成分轉運等(GO：0051179)。 在分子功能水平上進行分析(圖8)，結果顯示，它們主要具有核酸、脂質體等的結合作用(GO：0005488)，水解酶活性(GO：0003824)，RNA構成活性(GO：0005198)，翻譯延伸因子的轉運活性(GO：0005215)等功能。按照細胞組分水平分析(圖9)，這些基因編碼蛋白質可構成宿主細胞的細胞核(GO：0005623)、細胞膜(GO：0005576)等成分。

圖6 基于細胞成分水平對PSC-CW文庫序列的分析Fig.6 The analysis of the clone of the PSC-CW SSH library at cellular component level 2

圖7 基于生物過程水平對PSC-AW文庫序列進行分析Fig.7 The analysis of the clone of the PSC-AW SSH library at biological process level

圖8 基于分子功能水平對PSC-AW文庫序列進行分析Fig.8 The analysis of the clone of the PSC-AW SSH library at molecular function level

圖9 基于細胞成分水平對PSC-AW文庫序列的分析Fig.9 The analysis of the clone of the PSC-AW SSH library at cellular component level

3 討 論

寄生蟲的生活史比較復雜，需經過幾個不同發(fā)育階段來完成整個生命周期，每個階段的蟲體均有不同的形態(tài)結構和生理特點，需要不同的生活條件。因此，每個發(fā)育階段都有其特異表達的基因。目前，已經發(fā)現(xiàn)了一些危害較為嚴重的寄生蟲不同發(fā)育階段的差異表達基因。細粒棘球絳蟲的生長和發(fā)育是一個復雜的過程，存在4個發(fā)育階段，包蟲囊可大如西瓜、成蟲(絳蟲)細小而分節(jié)、原頭蚴及蟲卵期(六鉤蚴)僅能借助于顯微鏡才能看到，它們的生長發(fā)育、形態(tài)、行為和對環(huán)境的需求方面都有很大程度的不同。其原頭蚴和包囊是在羊等中間宿主體內生長發(fā)育的，而成蟲和蟲卵是在犬等終末宿主體內生長發(fā)育的。在實驗室條件和自然宿主體內，誘導細粒棘球蚴原頭蚴分別向包囊和成蟲方向分化生長，差異不顯著。在中間宿主體內，原頭蚴是在肝、肺等內臟器官中發(fā)育成包囊，而在終末宿主體內，原頭蚴寄生在腸道。本研究在實驗室條件下，利用培養(yǎng)基中成分的不同，將原頭蚴培養(yǎng)成包囊，同時，模擬犬腸道內環(huán)境，將原頭蚴培養(yǎng)成成蟲。但是細粒棘球蚴原頭蚴分別向包囊和成蟲方向分化生長過程中出現(xiàn)的階段性、差異性以及各發(fā)育階段產生的特性的內在機制尚不清楚，有待進一步研究。

SSH技術是1996年由L.Diatchenko等[2]在抑制性PCR和DNA差減雜交方法的基礎上，建立的一種分離和鑒定不同細胞或不同基因型差異表達基因和低豐度基因的方法。本實驗室曾經進行過相關試驗，但試驗結果不理想，測序結果顯示，大部分基因都是終末宿主犬體內的基因。在本研究中，首次以細粒棘球絳蟲幼蟲原頭蚴為驅動相，分別以包囊和成蟲為實驗相，獲得了PSC-CW和PSC-AW兩個差減文庫，繼而將差異PCR產物連接到pGEM-T 載體上，對其進行測序和同源性分析。

對PSC-CW文庫的測序結果進行初步分析(表1)，結果表明得到了16個基因序列，其中已知基因11個，出現(xiàn)頻率較高的有3個基因，分別編碼熱休克蛋白70(HSP70)、細胞色素C氧化酶I和類質粒復制起始蛋白，其他基因均只出現(xiàn)過一次，分別編碼線粒體蛋白、細胞色素C氧化酶Ⅲ、鐵蛋白等功能和調控蛋白。其中，EPCf08與編碼鐵蛋白的基因序列相似性為80.75%，鐵蛋白是原核生物和真核生物體內儲存鐵的一種蛋白質[5]。EPCContig4與編碼熱休克蛋白70(HSP70)的基因序列相似性為93.1%，HSP70是細胞水平上的一種分子監(jiān)控蛋白，參與蛋白質合成和細胞內囊泡的轉折和裝配[6]，而且此蛋白在許多原蟲感染過程中具有很高的免疫原性[7-9]。鑒于HSP70的功能，我們進行了克隆表達，進一步探討其在包蟲病防治方面可能的應用前景。EPCContig2，與編碼細胞色素C氧化酶I(coxI)的基因序列相似性為97.05%，coxI基因已被廣泛用來區(qū)分扁形動物的種間界限和系統(tǒng)發(fā)育的親和力，它在不同物種的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要意義[9-12]。對于從形態(tài)學差異無法區(qū)分的物種，可通過coxI基因序列分析加以區(qū)分，并可從系統(tǒng)發(fā)育學的角度闡述這種物種的形成過程，可作為物種的基因標志[13-15]。EPCc06，與編碼線粒體內膜移位酶Tim8的基因序列相似性為61.08%，線粒體內膜移位酶Tim8位于線粒體內膜，在部分營養(yǎng)成分進入線粒體的過程中起一定作用[16-18]。

上述PSC-CW文庫中的基因序列，從生物過程水平分析，基因序列EPCf08編碼的蛋白質在細胞內有運輸金屬離子等功能，如運輸鐵離子等二價和三價無機陽離子，從而維持細胞內平衡?；蛐蛄蠩PCe12-2編碼的蛋白質在線粒體中具有運輸ATP、氧和鐵離子等作用，在維持呼吸系統(tǒng)電子傳遞和磷酸化過程中起重要作用；基因序列EPCContig2編碼細胞內氧化呼吸作用及代謝過程中能量產生所需的酶；基因序列EPCc06編碼蛋白質導向和胞內蛋白轉運相關的蛋白質；基因序列EPCe06 e08編碼核糖體蛋白，在翻譯及生物大分子的合成中起重要作用；基因序列EPCContig4編碼的蛋白質能夠調節(jié)生長素等激素的合成和代謝及對刺激物的反應。從細胞組分角度上，其大多基因編碼的蛋白質參與合成線粒體、核糖體、細胞膜等生物器官。從分子功能上，其大多基因編碼的蛋白與離子、氧、ATP轉運有關，以維持細胞生長和代謝，其中基因序列EPCContig2和EPCe12-2具有細胞色素C活性，編碼運輸陽離子的跨膜蛋白；基因序列EPCf08編碼的蛋白質能轉運鐵離子等陽離子和氧；基因序列EPCe06、EPCContig4編碼的蛋白質具有RNA結合能力的結構分子。另外還有一部分克隆在GenBank中無法查到相對應的同源性基因，可能是一些新基因。

對PSC-AW文庫的測序結果進行初步分析，得到10個基因，其中6個為已知基因，且都是出現(xiàn)頻率較低的基因，分別編碼脂肪酸結合蛋白、基質蛋白和堿性磷酸酶等。其中，PA5與編碼脂肪酸結合蛋白的基因序列相似性為76.8%，脂肪酸結合蛋白接種動物后可誘導產生免疫保護[19]。有報道稱其能誘導動物產生抗血吸蟲的免疫保護效果，能夠作為預防血吸蟲病的候選疫苗[20]。在C.T.Fonseca等的研究中，脂肪酸結合蛋白能誘導小鼠產生免疫應答，在小鼠體內的荷蟲量減少24%～33%，肝中的蟲體數(shù)量減少27%～29%[21]。PA10與延伸因子1α(EF-1α)的基因序列相似性為98.85%，其在不同物種間具有高度保守性，可用于物種的種系發(fā)生分析，同時它還是一個多功能蛋白質，在翻譯過程中起重要作用[22-24]。以往確定細粒棘球絳蟲的亞類主要根據(jù)線粒體基因[25-30]。最近，研究者開始嘗試用核酸延伸因子1α(EF-1α)基因的序列和類型來區(qū)分細粒棘球絳蟲亞型[31-32]。M.Okamoto 等在細胞凋亡試驗中發(fā)現(xiàn)EF-1在轉錄過程中起重要作用，并調節(jié)細胞凋亡[32]。PA71與編碼基質蛋白1的基因序列相似性為89%，基質蛋白1 是細胞生長和發(fā)育過程中不可或缺的成分，它有誘導細胞分化的作用[33]。根據(jù)生化過程水平的分析，PA5與代謝產物的轉運和細胞識別有關，PA10在基因翻譯和表達以及細胞內蛋白質等大分子的合成和代謝等過程中發(fā)揮作用。分子功能水平分析表明，PA5、PA10、PA71和PA82能夠編碼一些調控蛋白，可調控信號轉導或基因表達等過程。細胞成分水平分析表明，A10為細胞質的組成成分，PA71是細胞膜的組織成分。同樣，PSC-AW文庫中也測得一些未知基因。

原頭蚴通過無性繁殖發(fā)育成包囊，這是一個緩慢的發(fā)育過程，3～6月才能發(fā)育成0.5 cm的包囊，原頭蚴進入中間宿主綿羊等體內，寄生在宿主的肝、肺等臟器，從宿主體內獲得營養(yǎng)成分，使自身得到繁殖，故需要營養(yǎng)轉運和能量獲取相關的蛋白質。本研究中，PSC-CW SSH文庫篩選出的基因大多能編碼和調控轉運營養(yǎng)和能量的功能性蛋白質，如coxI、鐵蛋白、coxⅢ和Tim8等，這與成囊期發(fā)育過程所需蛋白質相吻合。

原頭蚴通過有性繁殖發(fā)育成成蟲，原頭蚴進入終末宿主犬等體內，寄生在小腸內，約45 d后，犬開始排泄蟲卵，約10 d左右，大量蟲卵都脫落了，故成蟲發(fā)育較快，需要大量參與代謝的酶以及轉運蛋白，同時也需要大量構成細胞的組分。我們的研究中，PSC-AW SSH文庫中篩選獲得的基因主要參與生物發(fā)育與分化，可促進生物體的快速發(fā)育，這與成蟲階段的快速發(fā)育相一致。

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(編輯 白永平)

The Screening and Analysis of Differentially Expressed Genes in Suppression Subtractive Hybridization Library with either Cyst (CW) or Adult Worm (AM) Development fromEchinococcusgranulosusLarval Protoscolex (PSC)

ZHAO Li1#，SHI Bao-xin1#，LI Jun3，ZHANG Zhuang-zhi1，MA Zheng-hai2，ZHANG Xu1，XUE Jing1，JIN Ying-hong1，ZHANG Wen-bao3*

(1.VeterinaryResearchInstituteofAnimalScienceAcademyofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830000，China；2.XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering，CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China；3.XinjiangHydatidFundamentalMedicalKeyLab，F(xiàn)irstTeachingHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China)

According to the bidirectional development of the protoscolex (PSC) ofEchinococcusgranulosus，the study was conducted to screen the specifical genes ofE.granulosusPSC development between a larval cyst and adult worm.The subtractive PCR products of the SSH library ofE.granulosusPSC-adult (AW) andE.granulosusPSC-cyst (CW) were connected to the pGEM-T easy vector，and were cloned and sequenced.Totally，280 and 200 clones were obtained from PSC-CW and PSC-AM libraries，respectively，with the length of fragments 200 to 1000 bp.The clones were sequenced.Sequence alignment analysis showed that these sequences belong to 16 and 10 gene clusters representing 16 and 10 unique genes from PSC-CM and PSC-AW libraries respectively.As the genes are specifically or differentially expressed during the development of PSC to either adult worm or cyst，they are important for the parasite development and differentiation，thus can be candidates for drug and vaccine development.

Echinococcusgranulosus；suppression subtractive hybridization (SSH)；the specifical genes

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.019

2014-09-26

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項項目(201103008)

趙 莉(1982-)，女，江蘇宿遷人，碩士，助理研究員，主要從事生物化學與分子生物學研究，E-mail：82285053@qq.com；石保新(1963-)，男，河北館陶人，研究員，E-mail:2423930978@qq.com。石保新與趙莉為同等貢獻的第一作者

*通信作者：張文寶，研究員，E-mail：wenbaozhang2013@163.com

S852.734

A

0366-6964(2015)07-1215-09