邵俊高，張寶江，李善春，王彩蝶，王國勤，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛乳源金黃色葡萄球菌黏附素分子FnBPA不同功能區(qū)生物學(xué)活性的比較分析

邵俊高，張寶江，李善春，王彩蝶，王國勤，蘇 艷*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

旨在研究和比較牛乳源金黃色葡萄球菌黏附素分子A區(qū)(FnBPA-A)和BCD區(qū)(FnBPA-BCD)兩個功能區(qū)重組蛋白質(zhì)免疫后的生物學(xué)功能，并評價其作為抗原開展研制抗金黃色葡萄球菌疫苗的價值。利用原核表達載體pET-28a分別表達重組蛋白質(zhì)FnBPA-A與FnBPA-BCD，比較二者的黏附特性，并用純化后的重組蛋白質(zhì)單獨及聯(lián)合免疫方式免疫新西蘭白兔和小鼠，分析比較各組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的特異性抗體抑制菌體及對纖維蛋白原(Fg)、纖維連接素(Fn)的結(jié)合能力，免疫小鼠抗體水平及對小鼠的免疫保護力。結(jié)果表明，兩種重組蛋白質(zhì)具有不同的黏附活性，聯(lián)合免疫組產(chǎn)生的特異性抗體水平及與Fg、Fn的結(jié)合能力均較單獨免疫組高。重組蛋白質(zhì)FnBPA的A區(qū)及兩種蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組特異性抗體水平，抗血清對金黃色葡萄球菌Fg，F(xiàn)n黏附的抑制能力要優(yōu)于BCD區(qū)。免疫小鼠攻毒結(jié)果顯示各免疫組均對小鼠有良好的保護效果，其中FnBPA的A區(qū)蛋白質(zhì)免疫保護率高于其他試驗組。該研究的結(jié)果可為牛源金黃色葡萄球菌性的乳腺炎新型疫苗的優(yōu)化設(shè)計與合理應(yīng)用提供依據(jù)。

金黃色葡萄球菌；FnBPA-A；FnBPA-BCD；生物學(xué)活性

黏附素是金黃色葡萄球菌表面表達的特異性蛋白質(zhì)，可促進金黃色葡萄球菌與宿主細胞、細胞外基質(zhì)和可溶血漿蛋白的黏附，有助于該菌對宿主組織的侵入、定植和擴散，是金黃色葡萄球菌感染的重要一步[1-2]。幾乎所有的金黃色葡萄球菌都擁有FnBPA[3]，該蛋白質(zhì)已成為抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發(fā)的熱點分子[4]。 FnBPA蛋白有4個功能區(qū)，其中A區(qū)與D區(qū)最受關(guān)注：A區(qū)可介導(dǎo)細菌和纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)的結(jié)合[5-6]；D區(qū)也稱配基結(jié)合區(qū)，可介導(dǎo)細菌和纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)的結(jié)合[7]。研究表明 FnBPA 的免疫決定表位位于D區(qū)[8]。比較FnBPA的A區(qū)和D區(qū)片段表達蛋白質(zhì)的免疫原性，分析認(rèn)為D區(qū)蛋白質(zhì)的免疫特性優(yōu)于A區(qū)蛋白質(zhì)[9]。楊宏軍等擴增了FnBPA的A區(qū)進行亞單位疫苗的研制，亞單位疫苗的免疫效果較好[10]。趙艷等對FnBPA的D區(qū)進行了原核表達與分析，結(jié)果表明D區(qū)蛋白的抗體具有抗該菌黏附的作用[11]。對位于FnBPA蛋白不同功能區(qū)免疫后的抗黏附和免疫保護特性的比較分析還未見報道。本研究在對來自于牛乳源金黃色葡萄球菌FnBPA基因A區(qū)和BCD區(qū)表達的基礎(chǔ)上將純化后的重組蛋白質(zhì)免疫新西蘭白兔和C57BL/6小鼠，旨在比較和分析這兩種重組蛋白質(zhì)免疫生物學(xué)功能及免疫保護力的差異，為今后開展金黃色葡萄球菌性乳腺炎的免疫和防控提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑及實驗動物

奶牛乳源金黃色葡萄球菌分離株GY309，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實驗室分離鑒定并保存。原核表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)均為本實驗室保存，重組質(zhì)粒pMD18-T-309FnBPA質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建并保存。

限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI，DNA聚合酶，T4連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA Resin購自Transgen公司；HRP-IgG購自中杉金橋公司；Fibrinogen、 Fibronectin購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.5 kg雌性SPF級新西蘭大白兔，18～20 g雌性C57BL/6小鼠，均購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心。

1.2 目的片段擴增

根據(jù)pMD18-T-309FnBPA測序結(jié)果，用Oligo 7.0設(shè)計2對原核表達引物。F1：5′-GCGGAATTCACTAACGTTAATCATAT-3′(EcoRI酶切位點)；R1：5′-TATTCTCGAGTTTCAATGTATCCGTC-3′(XhoI酶切位點)；F2：5′-GCGGAATTCGAGGAATCAAATCCAATT-3′(EcoRI酶切位點)，R2：5′-TATTCTCGAGTTGTATCTTCTTCAATCG-3′(XhoI酶切位點)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以pMD18-T-309FnBPA質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸90 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 原核表達載體重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將FnBPA-A基因和FnBPA-BCD基因用EcoRI和XhoI雙酶切后，與經(jīng)相應(yīng)酶切的pET-28a(+)載體進行連接，獲得重組表達質(zhì)粒pET-28a-FnBPA-A和pET-28a-FnBPA-BCD。經(jīng)PCR、酶切鑒定正確，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達、純化

將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，篩選后接種至50 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600 nm達到0.4時，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG進行誘導(dǎo)。取10 μL樣品進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白質(zhì)。收集的菌體經(jīng)超聲破碎后，利用Ni層析柱對重組目的蛋白質(zhì)進行純化，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組蛋白質(zhì)Western blot分析

將重組蛋白質(zhì)FnBPA-A和FnBPA-BCD樣品各10 μL進行SDS-PAGE電泳后，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(300 mA，1 h)，以兔抗金黃色葡萄球菌抗血清為一抗(1∶4 000)，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶30 000)作為二抗，使用DAB顯色，水洗照相。

1.6 重組蛋白質(zhì)對纖維蛋白原(Fg)與纖連蛋白(Fn)的識別能力研究

采用ELISA法測定重組蛋白質(zhì)對Fg和Fn的識別能力。分別用每孔100 μL(50 ng)的Fg和Fn包被酶標(biāo)板，5%脫脂奶粉封閉后，每孔加入20 ng重組蛋白質(zhì)，加入1∶6 000倍稀釋的兔抗金黃色葡萄球菌全菌抗血清為一抗，1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，TMB溶液為顯色液，測OD450 nm值。

1.7 重組蛋白質(zhì)免疫試驗兔

8只新西蘭大白兔隨機分為4組，每組2只，分別為FnBPA-A重組蛋白質(zhì)免疫組、FnBPA-BCD重組蛋白質(zhì)免疫組、兩種重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組和空白對照組。免疫劑量為每只200 μg，首次免疫與等體積的弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫時重組蛋白質(zhì)與弗氏不完全佐劑等體積混合。采取背部皮下注射免疫?？瞻讓φ战M注射等體積的生理鹽水，免疫時間間隔為21 d。首次免疫后第0天、第14天和第28天兔耳中動脈采血，分離血清，檢測血清特異性抗體。

1.8 免疫兔血清抑制金黃色葡萄球菌與Fg和Fn黏附的檢測

分別用Fg(5 μg·mL-1) 100 μL 和Fn(6.25 μg·mL-1) 100 μL包被酶標(biāo)板。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌稀釋到OD600 nm=1.0與等體積1∶50倍稀釋的蛋白質(zhì)抗血清于37 ℃孵育60 min。將孵育后金黃色葡萄球菌加入到封閉后的酶標(biāo)板中，以未經(jīng)孵育的金黃色葡萄球菌作為對照，37 ℃作用2 h，PBST洗滌5次。30%甲醛溶液固定30 min，PBST洗滌5次。結(jié)晶紫染色10 min，PBST洗滌5次。用95%乙醇洗滌3次后測定OD450 nm值。

1.9 重組蛋白質(zhì)免疫小鼠及小鼠血清抗體效價的檢測

24只雌性C57BL/6小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為FnBPA-A重組蛋白質(zhì)免疫組，F(xiàn)nBPA-BCD重組蛋白質(zhì)免疫組、FnBPA-A+FnBPA-BCD重組蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組和PBS對照組，按50 μg·只-1皮下注射免疫，免疫程序同上，進行2次免疫。首次免疫后第0天、第14天和第28天采血，分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用間接ELISA法測定重組蛋白質(zhì)抗體水平。用每孔100 μL(100 ng)重組蛋白質(zhì)(FnBPA-A、FnBPA-BCD各50 ng)包被酶標(biāo)板，加入100 μL稀釋后的待檢血清(1∶300)，以1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗，TMB溶液顯色，測OD450 nm值。

1.10 小鼠攻毒試驗

首次免疫后第76天，取金黃色葡萄球菌接種于BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，以最小致死量2×109CFU(1MLD)，分別對FnBPA-A免疫組、FnBPA-BCD免疫組、FnBPA-A+FnBPA-BCD免疫組和PBS對照組各小鼠進行攻毒，攻毒后一周內(nèi)連續(xù)觀察，并記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 FnBPA-A和FnBPA-BCD重組表達質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET28a-FnBPA-A經(jīng)雙酶切后，獲得約為5 300和1 500 bp的條帶，重組質(zhì)粒pET28a-FnBPA-BCD經(jīng)雙酶切后，獲得約為5 300和800 bp的條帶，與理論值相符(圖1A和圖1B)，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒均含有目的基因。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒的EcoRI、XhoI雙酶切產(chǎn)物；2.空白質(zhì)粒的EcoRI、XhoI雙酶切產(chǎn)物；3.PCR擴增的FnBPA-A(A)或FnBPA-BCD(B)基因M.DNA molecular weight marker；1.Digestion of recombinant plasmid by EcoRI and XhoI；2.Digestion of pET28a(+) by EcoRI and XhoI；3.PCR product of FnBPA-A (A) or FnBPA-BCD (B) gene圖1 pET28a-FnBPA-A(A)和pET28a-FnBPA-BCD(B)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of the recombinant expression plasmid pET28a-FnBPA-A (A) and pET28a-FnBPA-BCD (B)

2.2 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達和純化

重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達后進行 SDS-PAGE 電泳，重組蛋白質(zhì)FnBPA-A在70 ku出現(xiàn)條帶(圖2A)，重組蛋白質(zhì)FnBPA-BCD在50 ku處出現(xiàn)明顯的條帶(圖2B)，與預(yù)期理論值相符，表明重組目的蛋白質(zhì)成功表達。

2.3 重組蛋白質(zhì)的 Western blot分析結(jié)果

以金黃色葡萄球菌全菌免疫兔抗血清分別與這兩種重組蛋白質(zhì)反應(yīng)，Western blot分析結(jié)果顯示，F(xiàn)nBPA-A蛋白在70 ku處出現(xiàn)條帶(圖3A)，F(xiàn)nBPA-BCD蛋白在50 ku處出現(xiàn)條帶(圖3B)，說明兩種重組蛋白質(zhì)可以與全菌免疫兔血清發(fā)生特異性的反應(yīng)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.FnBPA-A(A)或FnBPA-BCD(B)重組蛋白質(zhì)M.Protein molecular weight marker；1.FnBPA-A (A) or FnBPA-BCD (B) protein圖3 重組蛋白質(zhì) FnBPA-A(A)和FnBPA-BCD(B)的Western blot鑒定Fig.3 Western blot analysis of FnBPA-A (A) and FnBPA-BCD (B) protein

2.4 重組蛋白質(zhì)FnBPA-A及FnBPA-BCD對纖維蛋白原(Fg)與纖連蛋白(Fn)黏附活性

FnBPA不同功能區(qū)的重組蛋白對Fg和Fn結(jié)合能力的檢測結(jié)果表明(圖4)，重組蛋白質(zhì)FnBPA-A對Fg結(jié)合高于FnBPA-BCD(P<0.01)(圖4A)；FnBPA-BCD重組蛋白質(zhì)對Fn結(jié)合高于FnBPA-A(P<0.01)(圖4B)。

A.重組蛋白質(zhì)對Fg結(jié)合檢測結(jié)果；B.重組蛋白質(zhì)對Fn結(jié)合的檢測結(jié)果。與對照組相比，＊.P<0.05；＊＊.P<0.01。下圖同A.Binding activity of the recombinant proteins with fibrinogen；B.Binding activity of the recombinant proteins with fibronectin.Compared with the control group，＊.P<0.05；＊＊.P<0.01.The same as below圖4 FnbPA-A及FnBPA-BCD重組蛋白質(zhì)對纖維蛋白原(Fg)與纖連蛋白(Fn)黏附活性比較Fig.4 Comparison binding activity of the recombinant proteins to fibrinogen and fibronectin

2.5 重組蛋白質(zhì)免疫血清抑制金黃色葡萄球菌與Fg和Fn黏附的檢測

分別以兔不同免疫組抗血清和金黃色葡萄球菌進行作用，比較不同組抗血清抑制金黃色葡萄球菌與Fg、Fn結(jié)合能力。黏附抑制的結(jié)果表明，F(xiàn)nBPA-A免疫組抗血清抑制金黃色葡萄球菌與Fg黏附的效果優(yōu)于FnBPA-BCD免疫組(P<0.01)(圖5A)，F(xiàn)nBPA-BCD免疫組抗血清抑制金黃色葡萄球菌與Fn黏附的效果優(yōu)于FnBPA-A免疫組(P<0.01)(圖5B)，聯(lián)合免疫組抗血清抑制金黃色葡萄球菌與Fg和Fn黏附的能力顯著強于單獨免疫組(P<0.05或P<0.01)(圖5)。

A.抗血清抑制金黃色葡萄球菌對Fg的黏附；B.抗血清抑制金黃色葡萄球菌對Fn的黏附A.Anti-adherence assays of the serums with fibrinogen；B.Anti-adherence assays of the serums with fibronectin圖5 重組蛋白質(zhì)FnBPA-A、FnBPA-BCD和聯(lián)合免疫組抗血清對金黃色葡萄球菌的黏附抑制Fig.5 Anti-adherence assays of the serums to fibrinogen and fibronectin

2.6 小鼠免疫后抗體水平檢測

采用間接ELISA方法分別對4組首免前、首免后第14天和首免后第28天的小鼠免疫抗血清進行抗體效價的檢測。與免疫前相比不同組在免疫后抗體效價均有明顯提高，隨著免疫時間推移，抗體效價逐漸上升，且在第二次免疫后抗體效價達到高峰(圖6A)。其中FnBPA-A免疫組與FnBPA-A+FnBPA-BCD免疫組的效價相近，均高于FnBPA-BCD免疫組與空白對照組(圖6B)。

A.鼠免疫重組蛋白質(zhì)后血清效價消長變化；B.鼠免疫后血清抗體滴度A.Titeration of antibody against FnBPA-A and FnBPA-BCD in blood serum of immunized mice；B.Determination of serum antibody titers against FnBPA-A and FnBPA-BCD of immunized mice圖6 鼠免疫重組蛋白質(zhì)FnBPA-A和FnBPA-BCD后血清效價消長變化和血清抗體滴度Fig.6 Titeration and change of antibody against FnBPA-A and FnBPA-BCD in serum of immunized mice

2.7 免疫小鼠的免疫保護力試驗

初次免疫后第76天，選取牛源金黃色葡萄球菌GY309分離株 (攻毒劑量1MLD)攻毒，觀察小鼠死亡情況。結(jié)果顯示，攻毒后72 h，對照組全部死亡，F(xiàn)nBPA-A免疫組的保護率為83.3%，F(xiàn)nBPA-BCD免疫組的保護率為50%，聯(lián)合免疫組的保護率為66.7%。試驗結(jié)果顯示各免疫組對金黃色葡萄球菌的攻擊均具有一定保護效果，F(xiàn)nBPA-A免疫組的免疫保護效果優(yōu)于FnBPA-BCD免疫組。

3 討 論

以往通過對金黃色葡萄球菌感染機體過程的研究，發(fā)現(xiàn)該菌的黏附蛋白與哺乳動物上皮細胞外基質(zhì)黏附能力的大小可直接影響其致病力[12]。黏附和定植是金黃色葡萄球菌感染寄主細胞的首要條件[4]。以往的研究對FnBPs蛋白的研究多集中于D區(qū)[9，11，13]。鑒于FnBPA的A區(qū)和BCD區(qū)在黏附過程中分別結(jié)合宿主細胞表面的Fg和Fn分子，為實現(xiàn)對該菌感染的有效控制，有必要對該分子的不同功能區(qū)分別表達，進而比較二者在免疫原性、抗體的抗黏附能力及免疫保護力等方面的差異。

研究表明，不同地區(qū)流行菌株FnBPA-A具有其各自的特點[14]。目前的研究發(fā)現(xiàn)具有Fn結(jié)合能力的D區(qū)產(chǎn)生的抗體絕大多數(shù)不能和FnbpA無定型的重復(fù)序列結(jié)合，只有當(dāng)無定型的重復(fù)序列與Fn結(jié)合后，該抗體才能與其結(jié)合，因此D區(qū)產(chǎn)生的抗體不能有效地阻斷細菌的侵入，這對免疫保護來說是不利的。此外D區(qū)片段過小，并且沒有固定的二級結(jié)構(gòu)[6，15]。因此對于動物機體的免疫保護來說，需要重新評估D區(qū)的作用。

本研究將純化后的重組蛋白質(zhì)分別結(jié)合Fg和Fn分子，重組蛋白質(zhì)FnBPA的A區(qū)結(jié)合Fg的能力要優(yōu)于 BCD區(qū)，重組蛋白質(zhì)FnBPA的BCD區(qū)對Fn的結(jié)合能力優(yōu)于A區(qū)。這一點與以往的關(guān)于FnBPA不同功能區(qū)黏附特性的研究結(jié)果一致[5，7]。

重組蛋白質(zhì)免疫兔抗體在抑制金黃色葡萄球菌與Fg和Fn的黏附的檢測結(jié)果表明，重組蛋白質(zhì)FnBPA的A區(qū)及兩種蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組抗血清對金黃色葡萄球菌Fg黏附的抑制能力要優(yōu)于BCD區(qū)。重組蛋白質(zhì)FnBPA的BCD區(qū)及兩種蛋白質(zhì)聯(lián)合免疫組抗血清對金黃色葡萄球菌黏附Fn的抑制能力要優(yōu)于A區(qū)。M.C.Gaudreau等也證明在金黃色葡萄球菌ClfA DNA疫苗免疫小鼠后抗體可抑制細菌對Fg的黏附[16]。

免疫小鼠的抗體檢測結(jié)果顯示，重組蛋白質(zhì)FnBPA的A區(qū)誘導(dǎo)抗體的能力略優(yōu)于BCD區(qū)，這與何焱等[9]用D區(qū)蛋白質(zhì)免疫后得出D區(qū)蛋白質(zhì)的免疫效果優(yōu)于A區(qū)蛋白質(zhì)不完全一致，分析原因可能與我們表達的BCD區(qū)蛋白質(zhì)大小與其表達的D區(qū)不完全相同有關(guān)。

綜合本試驗的結(jié)果可以得出，F(xiàn)nBPA的A區(qū)重組蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)抗體的水平、其誘導(dǎo)的抗體抑制金黃色葡萄球菌與Fg的黏附及其免疫后對免疫小鼠的保護力方面均優(yōu)于BCD區(qū)。聯(lián)合免疫組雖在誘導(dǎo)小鼠抗體水平和抑制金黃色葡萄球菌與Fg和Fn黏附方面優(yōu)于A區(qū)和BCD區(qū)重組蛋白質(zhì)單獨免疫組，但對免疫小鼠的保護力方面卻低于FnBPA的A區(qū)單獨免疫組。分析可能存在兩方面的原因，一是因為免疫保護效果并不是抗體水平的簡單疊加，即使聯(lián)合免疫組總的抗體水平高，其免疫保護力不一定高；其次可能是在聯(lián)合免疫過程中免疫原之間存在著免疫干擾。

FnBPA的A區(qū)的免疫保護性不應(yīng)當(dāng)被忽視，應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作有潛力的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌亞單位疫苗的候選區(qū)域，且A區(qū)片段較大，二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適合做免疫原。

[1] LAMMERS A，NUIJTEN P J，KRUIJT E，et al.Cell tropism ofStaphylococcusaureusin bovine mammary gland cell cultures[J].VetMicrobiol，1999，67(2)：77-89.

[2] 陳懷青，陸承平.金黃色葡萄球菌的粘附素[J].中國人獸共患病雜志，1996，12(6)：43-44. CHEN H Q，LU C P.The adhesins ofStaphylococcusaureus[J].ChineseJournalofZoonoses，1996，12(6)：43-44.(in Chinese)

[3] 周 宏，李韓平，姜永強，等.金黃色葡萄球菌表面蛋白研究進展[J].生物技術(shù)通訊，2004，15(1)：73-75. ZHOU H，LI H P，JIANG Y Q，et al.The progress ofStaphylococcusaureussurface proteins[J].LettersinBiotechnology，2004，15(1)：73-75.(in Chinese)

[4] 任士飛，徐建生，董國雄，等.細菌黏附研究進展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26(3)：238-240. REN S F，XU J S，DONG G X，et al.Progress in research of bacterial adherence[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2004，26(3)：238-240.(in Chinese)

[5] KEANE F M，LOUGHMAN A，VALTULINA V，et al.Fibrinogen and elastin bind to the same region within the A domain of fibronection binding protein A，an MSCRAMM ofStaphylococcusaureus[J].MolMicrobiol，2007，63(3)：711-723.

[6] LOUGHMAN A，SWEENEY T，KEANE F M，et al.Sequence diversity in the A domain ofStaphylococcusaureusfibronectin-binding protein A[J].BMCMicrobiol，2008，8：74.

[7] CASOLINI F，VISAI L，JOH D，et al.Antibody response to fibronectin-binding adhesin FnbpA in patients withStaphylococcusaureusinfections[J].InfectImmun，1998，66(11)：5433-5442.

[8] JOH H J，HOURSE P K，PATTI J M，et al.Fibronectin receptors from Gram-positive bacteria：comparison of active sites[J].Biochemistry，1994，33(20)：6086-6092.

[9] 何 焱，謝紅霞，楊 嵐，等.牛源金黃色葡萄球菌FnBPA A基因與D基因表達產(chǎn)物的免疫原性比較[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44(5)：480-484. HE Y，XIE H X，YANG L，et al.Comparison of immunogenicity between the expressed proteins of FnBP A gene and D gene ofStaphylococcusaureusfrom cattle[J].ChineseVeterinaryScience，2014，44(5)：480-484.(in Chinese)

[10] 楊宏軍，高運東，王長法，等.金黃色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能區(qū)基因的克隆和原核表達[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，36(1)：54-58. YANG H J，GAO Y D，WANG C F，et al.Cloning and expression of the functional Fnbp A gene ofStaphylococcusaureusadhesin[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)，2008，36(1)：54-58.(in Chinese)

[11] 趙 艷，張愛榮，郝永清.金黃色葡萄球菌的FnBPA D基因片段的表達[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31(5)：361-365. ZHAO Y，ZHANG A R，HAO Y Q.Cloning and expression of the D fragment of fibronectin-binding protein A gene fromStaphylococcusaureus[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2009，31(5)：361-365.(in Chinese)

[12] BROUILLETTE E，LACASSE P，SHKRETA L，et al.DNA immunization against the clumping factor A (ClfA) ofStaphylococcusaureus[J].Vaccine，2002，20(17-18)：2348-2357.

[13] 史冬艷，郝永清，張愛榮.奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌FnbpB-D基因的表達及其抗血清活性[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(5)：356-359. SHI D Y，HAO Y Q，ZHANG A R.Expression of fibronectin-binding protein B (FnbpB) region D ofStaphylococcusaureusand antiserum activity[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2010，32(5)：356-359.(in Chinese)

[14] 張向新，石慶華，王世民，等.新疆奶牛乳腺炎致病性金黃色葡萄球菌FnbpA 基因的克隆與序列分析[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，33(5)：422-426. ZHANG X X，SHI Q H，WANG S M，et al.Clone and sequence analysis of FnbpA gene of Staphylococcusaureusisolated from Xinjiang dairy cow with subclinical Mastitis[J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity，2010，33(5)：422-426.(in Chinese)

[15] 范 鑫，郝永清，張愛榮，等.金黃色葡萄球菌黏附素FnBPB-ClFA共表達質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(2)：173-177. FAN X，HAO Y Q，ZHANG A R，et al.Construction and prokaryotic expression of the co-expression plasmid with FnBPB-ClFA gene encodingStaphylococcusaureusadhesion[J].ChineseVeterinaryScience，2011，41(2)：173-177.(in Chinese)

[16] GAUDREAU M C，LACASSE P，TALBOT B G.Protective immune responses to a multi-gene DNA vaccine againstStaphylococcusaureus[J].Vaccine，2007，25(5)：814-824.

(編輯 白永平)

Comparison and Analysis of the Biological Activity of Antiserum after Immunizing with Expressed Different Domains ofStaphylococusaureusAdhesin FnBPA Isolated from Bovine Milk

SHAO Jun-gao，ZHANG Bao-jiang，LI Shan-chun，WANG Cai-die，WANG Guo-qin，SU Yan*

(VeterinaryMedicineCollegeofXinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China)

The aim of this study was to express FnBPA-A(A domain of fibrinogen-binding region A)and FnBPA-BCD (BCD domain of fibrinogen-binding region A different domains of FnBPA) ofStaphylococcusaureus，and compare the adhesion inhibition activities of their antiserum for prevention of bovine mastitis caused byS.aureus.FnBPA-A and FnBPA-BCD encoding genes were cloned and inserted into pET-28a vector.Then the recombinant proteins were expressed and purified to immune Newzeland rabbits and mice.The adhesin binding ability，adhesion inhibition activity of their serum antibody and challenge protection ability were tested.The results showed that the antibody level，the binding ability to Fg and Fn and adhesion inhibition activity of FnBPA-A and FnBPA-BCD co-immunization group were better than that of single immunization groups.The mice antibody level of FnBPA-A immunization group and co-immunization group were better than that of FnBPA-BCD immunization group.In addition，F(xiàn)nBPA-A and co-immunization group showed better adhesion inhibition activity to Fg，F(xiàn)nBPA-BCD and co-immunization group showed better adhesion inhibition activity to Fn.The immunological protection result showed that each group had good protective effect and FnBPA-A immunization group was the best one.The results of this study may provide the basis for design of new vaccines of bovine mastitis caused byS.aureus.

Staphylococcusaureus；FnBPA-A；FnBPA-BCD；adhesion activity；biological activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.018

2014-10-28

新疆維吾爾自治區(qū)高新技術(shù)項目 (201311108)；國家自然科學(xué)基金(31260222；31160191)；自治區(qū)普通高校重點學(xué)科基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)科資助項目

邵俊高(1989-)，男，江蘇鹽城人，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物及免疫研究，E-mail:shaojungao1108@163.com

*通信作者：蘇 艷,女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物分子致病與免疫研究，E-mail: 2006au@163.com

S852.611

A

0366-6964(2015)07-1208-07