芮 萍，劉曜綜，馬增軍，王秋悅，楊彩然，劉謝榮

（河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，秦皇島066004）

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV），又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科。PRV具有廣泛的宿主譜，豬是主要貯存宿主和傳染源。PRV主要引起家畜和多種野生動物出現(xiàn)以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染?。?－3］。自2011 年以來，在四川、黑龍江、吉林、江蘇等地許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了PR流行，同時在不同地區(qū)分離出了PRV變異株［4－8］。與此同時，PRV不僅在本地區(qū)豬群中蔓延，在家養(yǎng)毛皮動物中普遍發(fā)生疑似偽狂犬病，呈現(xiàn)地區(qū)性暴發(fā)趨勢，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒感染狐、貂、貉表現(xiàn)持續(xù)搔癢、自咬、興奮不安、神經(jīng)麻痹、消瘦、腹瀉、失明或呼吸困難等癥狀。甚至有些狐、貂并無明顯臨床癥狀，突然死亡。

為了證實流行疫病為偽狂犬病毒感染所致，本試驗通過對疑似偽狂犬病病料處理、病毒分離鑒定、PRVgE基因擴(kuò)增與序列分析，為認(rèn)識貂源流行病毒分子特征、疫情的防控以及疫苗研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料、細(xì)胞及實驗動物

腦組織病料來源于河北省昌黎縣某水貂飼養(yǎng)場，表現(xiàn)為興奮不安、尖叫、腹瀉等疑似偽狂犬癥狀的病死成年水貂。MDCK細(xì)胞由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；家兔由河北科技師范學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基為GIBCO產(chǎn)品，胎牛血清為WISENT產(chǎn)品，LaTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture、2×GC BufferⅡ購自TaKaRa生物科技（大連）有限公司。

1.3 病毒基因組的提取及PCR擴(kuò)增

以組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取核酸。參照文獻(xiàn)方法合成引物，PCR擴(kuò)增［9］。

1.4 病毒分離與純化

將PCR鑒定為陽性的腦組織勻漿液，采用0.22 μm濾器過濾除菌后接種MDCK單層細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變（CPE）。待CPE達(dá)80%左右時收毒，凍融后取上清。將收獲的病毒液經(jīng)過3輪空斑純化后接種MDCK細(xì)胞，收獲病毒液凍存于－70℃。

1.5 病毒粒子的電鏡觀察

取MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)的第3代病毒液用2%磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.6 免疫熒光鑒定（IFA）

將分離病毒接種6孔板中的MDCK細(xì)胞，24h后棄培養(yǎng)液，以預(yù)冷的丙酮固定30min，分別加1∶200稀釋的一抗500μL，37℃孵育1h，用GFP標(biāo)記兔抗豬二抗37℃孵育1h，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 動物接種試驗

將經(jīng)純化后的病毒液按1∶100稀釋后接種2只家兔，每只皮下注射1mL，另2只對照家兔分別注射1mL DMEM維持液。

1.8 gE基因序列分析

以提取的病毒分離株細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA為模板，對gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGM－T載體中進(jìn)行序列測定。利用DNAS－tar7.1生物學(xué)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 病料樣品檢測

將疑似偽狂犬病貂的腦組織勻漿后提取DNA，用gE特異性引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果擴(kuò)增出約1 700bp的DNA片段（圖1），表明送檢樣品為PRV陽性。

圖1 貂腦組織樣品gE基因PCR鑒定Fig.1 PCR amplification of PRV gEfragments from mink brain sample

2.2 病毒的分離及鑒定

將陽性腦組織勻漿液過濾除菌后接種MDCK單層細(xì)胞，盲傳至第2代時，在接毒后20h產(chǎn)生明顯CPE（圖2），可見細(xì)胞膨大變圓，失去光澤，形成合胞體，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)折光性增強(qiáng)，48h后90%細(xì)胞脫落。利用gE特異性引物對培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定，能夠擴(kuò)增到預(yù)期片段。將F3代培養(yǎng)物負(fù)染后進(jìn)行電鏡檢測，可以觀察到病毒粒子近似球形，直徑150～180nm，有囊膜，且囊膜上有凸起（圖3）。將分離毒株命名為Mink 1。

圖2 病料腦組織勻漿上清液感染MDCK細(xì)胞引起的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathogenic effects of MDCK cells inoculated with homogenated brain tissue supernatant

圖3 病毒粒子的電鏡觀察 （Bar＝100nm）Fig.3 The morphology of virus particles under electron microscope（Bar＝100nm）

2.3 IFA鑒定

分離病毒感染MDCK細(xì)胞后，用PRV陽性血清做IFA檢測。如圖4所示，病毒感染能產(chǎn)生典型合胞體病變，合胞體能與PRV陽性血清作用，顯示強(qiáng)烈熒光，這證實分離病毒確為PRV。

圖4 病毒的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.4 IFA identification of the isolated virus

2.4 動物接種試驗

家兔接種病毒后于58h出現(xiàn)興奮不安、陣發(fā)性抽搐，撕咬接種部位，繼而出現(xiàn)前肢麻痹，在接種后60h角弓反張死亡。注射DMEM培養(yǎng)液的對照家兔無任何臨床癥狀。

2.5 病毒核酸gE全基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用PCR擴(kuò)增完整的gE基因編碼區(qū)，克隆于pGM－T中進(jìn)行測序，獲得1 757bp基因片段。對gE核苷酸序列與其他毒株序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mink 1基因序列與國內(nèi)外其他對應(yīng)序列相比有5個獨特的核苷酸突變，第96位（G→T）、136位（T→C）、317位（T→C）、943位（G→C）、1 052位（G→A），另外，還有6處突變與2012年之后國內(nèi)分離株普遍存在的突變位點相同，分別是142－144位GAC插入，161位G→A，228位C→A，1 343位G→A，1 487－1 490位ACG插入，1 535位G→A。核苷酸序列相似性分析結(jié)果表明Mink 1株與其他毒株gE基因相似性為97.1%～99.4%，與XiangA株和ZM株相似性最高，為99.4%。Mink 1株和部分2012年新分離的毒株位于一個相對獨立的分支中，而與以前分離的毒株親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5。

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis

3 討 論

本研究通過采集疑似偽狂犬病水貂病料，將PCR檢測陽性病料接種MDCK細(xì)胞，并通過電鏡形態(tài)和免疫熒光觀察，初步證實從發(fā)病水貂腦組織中分離出1株P(guān)RV野毒株。將經(jīng)蝕斑純化后的病毒液接種家兔，試驗組家兔在接種病毒后出現(xiàn)明顯的偽狂犬癥狀，皮膚瘙癢，用嘴啃咬注射部位，興奮不安，繼而出現(xiàn)四肢麻痹，最終角弓反張死亡。

由于目前缺乏對貂偽狂犬病的詳細(xì)描述資料，該病常被誤診為鏈球菌性腦炎、犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎。PRV基因組GC含量高達(dá)70%，設(shè)計檢測病毒的PCR引物難度較大，有時造成檢測樣品不夠敏感，確診該病最有力的證據(jù)仍是分離獲得病毒。在病料的檢測過程中，發(fā)現(xiàn)腦組織的病毒含量高，應(yīng)盡量以發(fā)病貂的腦組織作為檢測材料。

對gE基因的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Mink 1分離毒株gE基因與國內(nèi)外其他豬源參考毒株gE基因相似性在97%以上，與2012年新近分離的豬源偽狂犬病毒株遺傳關(guān)系近，位于一個相對獨立的分支中，與以前分離的毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。盡管這些病毒株能否形成一個新的流行毒株群還有待更多的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)來驗證。但可以推斷，當(dāng)前本地區(qū)流行的貂源PRV可能由豬源PRV變異毒株而來，這與對犬的相關(guān)報道相似［10］。序列突變分析顯示，Mink 1同時存在142—144位GAC和1 487—1 490位ACG兩處特征性插入，并在1 535位、161位、228位等11處發(fā)生點突變。這些插入或點突變是否與病毒毒力增強(qiáng)有關(guān)，其功能有待進(jìn)一步研究。此外，除gE基因外的其他PRV基因是否發(fā)生了更多突變，從而使其得以在不同宿主間傳播也需要更進(jìn)一步的研究探索。

近年來，偽狂犬病病毒呈現(xiàn)變異速度加快、毒力增強(qiáng)、跨種感染增多的趨勢。在狐、貉、貂等毛皮動物飼養(yǎng)較密集的區(qū)域，大量出現(xiàn)偽狂犬病臨床癥狀為主要表現(xiàn)的病癥，且呈暴發(fā)流行趨勢。據(jù)病史調(diào)查，病獸既有生食豬、牛、羊等動物產(chǎn)品的病史，也有無生食動物產(chǎn)品病史；有的毛皮動物養(yǎng)殖場毗鄰豬場，有的距離養(yǎng)豬場較遠(yuǎn)，因此，感染途徑除了經(jīng)消化道感染以外，不排除通過空氣傳播豬源PRV的可能性。因此，毛皮動物養(yǎng)殖場應(yīng)距離豬場較遠(yuǎn)些，平時要做好隔離消毒措施。同時要加強(qiáng)豬偽狂犬病的防疫，是有效防控毛皮動物偽狂犬病的重要措施。

4 結(jié) 論

首次報道從發(fā)病水貂中分離鑒定PRV，并對其gE基因序列進(jìn)行測定，經(jīng)電鏡形態(tài)、免疫熒光觀察，以及PCR檢測證實分離到病毒，命名為 Mink 1。gE基因進(jìn)化分析表明，該毒株與2012年以來豬偽狂犬變異株的相似性高達(dá)99.4%，位于一個相對獨立的分支。

（

）：

［1］SHAHAN M S，KNUDSON R L.Aujeszky’s disease（pseudorabies）a review，with notes on two strains of the virus［J］.NorthAmVet，1947，28（8）：511－521.

［2］KLUPP B G，LOMNICZI B，VISSER N，et al.Mutations affecting the UL21gene contribute to avirulence of pseudorabies virus vaccine strain Bartha［J］.Virology，1995，212（2）：466－473.

［3］METTENLEITER T C.Aujeszky’s disease（pseudorabies）virus：the virus and molecular pathogenesisstate of the art，June 1999［J］.VetRes，2000，31（1）：99－115.

［4］童 武，張青占，鄭 浩，等.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2013，21（3）：1－7.

TONG W，ZHANG Q Z，ZHENG H，et al.Identification and characterization of a pseudorabies virus isolated from a dead piglet born to vaccinated sow［J］.ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases，2013，21（3）：1－7.（in Chinese）

［5］吳云飛，朱 玲，徐志文，等.偽狂犬病病毒四川株的分離鑒定及增殖特性［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（6）：557－564.

WU Y F，ZHU L，XU Z W，et al.Identification of pseudorabies virus from pigs in Sichuan Province and its proliferation characterization［J］.ChineseVeterinaryScience，2013，43（6）：557－564.（in Chinese）

［6］AN T Q，PENG J M，TIAN Z J，et al.Pseudorabies virus variant in Bartha－K61－vaccinated pigs，China，2012［J］.EmergInfectDis，2013，19（11）：1749－1755.

［7］郝 飛，湯德元，李春燕，等.偽狂犬病病毒Guizhou－DY株的分離鑒定及致病性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44（11）：1851－1856.

HAO F，TANG D Y，LI C Y，et al.Identification and pathogenicity study of pseudorabies virus Guizhou－DY strain［J］.ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44（11）：1851－1856.（in Chinese）

［8］趙鴻遠(yuǎn)，彭金美，安同慶，等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36（7）：506－509.

ZHAO H Y，PENG J M，AN T Q，et al.Identification of glycoprotein E characteristic in pseudorabies virus variants from swine［J］.ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2014，36（7）：506－509.（in Chinese）

［9］彭金美，王 瑜，田志軍，等.帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其體外生長特性研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（1）：10－15.

PENG J M，WANG Y，TIAN Z J，et al.Construction of a recombinant pseudorabies virus with BAC plasmid insertion in the Tkgene［J］.ChineseJournalof PreventiveVeterinaryMedicine，2009，31（1）：10－15.（in Chinese）

［10］鐘 承，張樂天，王巨實，等.犬源偽狂犬病毒BJ/RD株的分離鑒定及gE基因分析［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2013，21（5）：1－6.

ZHONG C，ZHANG L T，WANG J S，et al.Isolation and Identification of canine pseudorabies virus BJ/RD strain and sequence analysis of itsgEgene［J］.ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases，2013，21（5）：1－6.（in Chinese）