芮 萍，劉曜綜，馬增軍，王秋悅，楊彩然，劉謝榮

（河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島066004）

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV），又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科。PRV具有廣泛的宿主譜，豬是主要貯存宿主和傳染源。PRV主要引起家畜和多種野生動(dòng)物出現(xiàn)以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染?。?－3］。自2011 年以來(lái)，在四川、黑龍江、吉林、江蘇等地許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了PR流行，同時(shí)在不同地區(qū)分離出了PRV變異株［4－8］。與此同時(shí)，PRV不僅在本地區(qū)豬群中蔓延，在家養(yǎng)毛皮動(dòng)物中普遍發(fā)生疑似偽狂犬病，呈現(xiàn)地區(qū)性暴發(fā)趨勢(shì)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒感染狐、貂、貉表現(xiàn)持續(xù)搔癢、自咬、興奮不安、神經(jīng)麻痹、消瘦、腹瀉、失明或呼吸困難等癥狀。甚至有些狐、貂并無(wú)明顯臨床癥狀，突然死亡。

為了證實(shí)流行疫病為偽狂犬病毒感染所致，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)疑似偽狂犬病病料處理、病毒分離鑒定、PRVgE基因擴(kuò)增與序列分析，為認(rèn)識(shí)貂源流行病毒分子特征、疫情的防控以及疫苗研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

腦組織病料來(lái)源于河北省昌黎縣某水貂飼養(yǎng)場(chǎng)，表現(xiàn)為興奮不安、尖叫、腹瀉等疑似偽狂犬癥狀的病死成年水貂。MDCK細(xì)胞由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；家兔由河北科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基為GIBCO產(chǎn)品，胎牛血清為WISENT產(chǎn)品，LaTaqDNA 聚合酶、dNTP Mixture、2×GC BufferⅡ購(gòu)自TaKaRa生物科技（大連）有限公司。

1.3 病毒基因組的提取及PCR擴(kuò)增

以組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取核酸。參照文獻(xiàn)方法合成引物，PCR擴(kuò)增［9］。

1.4 病毒分離與純化

將PCR鑒定為陽(yáng)性的腦組織勻漿液，采用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后接種MDCK單層細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變（CPE）。待CPE達(dá)80%左右時(shí)收毒，凍融后取上清。將收獲的病毒液經(jīng)過(guò)3輪空斑純化后接種MDCK細(xì)胞，收獲病毒液凍存于－70℃。

1.5 病毒粒子的電鏡觀察

取MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)的第3代病毒液用2%磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.6 免疫熒光鑒定（IFA）

將分離病毒接種6孔板中的MDCK細(xì)胞，24h后棄培養(yǎng)液，以預(yù)冷的丙酮固定30min，分別加1∶200稀釋的一抗500μL，37℃孵育1h，用GFP標(biāo)記兔抗豬二抗37℃孵育1h，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 動(dòng)物接種試驗(yàn)

將經(jīng)純化后的病毒液按1∶100稀釋后接種2只家兔，每只皮下注射1mL，另2只對(duì)照家兔分別注射1mL DMEM維持液。

1.8 gE基因序列分析

以提取的病毒分離株細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA為模板，對(duì)gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGM－T載體中進(jìn)行序列測(cè)定。利用DNAS－tar7.1生物學(xué)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 病料樣品檢測(cè)

將疑似偽狂犬病貂的腦組織勻漿后提取DNA，用gE特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果擴(kuò)增出約1 700bp的DNA片段（圖1），表明送檢樣品為PRV陽(yáng)性。

圖1 貂腦組織樣品gE基因PCR鑒定Fig.1 PCR amplification of PRV gEfragments from mink brain sample

2.2 病毒的分離及鑒定

將陽(yáng)性腦組織勻漿液過(guò)濾除菌后接種MDCK單層細(xì)胞，盲傳至第2代時(shí)，在接毒后20h產(chǎn)生明顯CPE（圖2），可見(jiàn)細(xì)胞膨大變圓，失去光澤，形成合胞體，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)折光性增強(qiáng)，48h后90%細(xì)胞脫落。利用gE特異性引物對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定，能夠擴(kuò)增到預(yù)期片段。將F3代培養(yǎng)物負(fù)染后進(jìn)行電鏡檢測(cè)，可以觀察到病毒粒子近似球形，直徑150～180nm，有囊膜，且囊膜上有凸起（圖3）。將分離毒株命名為Mink 1。

圖2 病料腦組織勻漿上清液感染MDCK細(xì)胞引起的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathogenic effects of MDCK cells inoculated with homogenated brain tissue supernatant

圖3 病毒粒子的電鏡觀察 （Bar＝100nm）Fig.3 The morphology of virus particles under electron microscope（Bar＝100nm）

2.3 IFA鑒定

分離病毒感染MDCK細(xì)胞后，用PRV陽(yáng)性血清做IFA檢測(cè)。如圖4所示，病毒感染能產(chǎn)生典型合胞體病變，合胞體能與PRV陽(yáng)性血清作用，顯示強(qiáng)烈熒光，這證實(shí)分離病毒確為PRV。

圖4 病毒的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.4 IFA identification of the isolated virus

2.4 動(dòng)物接種試驗(yàn)

家兔接種病毒后于58h出現(xiàn)興奮不安、陣發(fā)性抽搐，撕咬接種部位，繼而出現(xiàn)前肢麻痹，在接種后60h角弓反張死亡。注射DMEM培養(yǎng)液的對(duì)照家兔無(wú)任何臨床癥狀。

2.5 病毒核酸gE全基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用PCR擴(kuò)增完整的gE基因編碼區(qū)，克隆于pGM－T中進(jìn)行測(cè)序，獲得1 757bp基因片段。對(duì)gE核苷酸序列與其他毒株序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mink 1基因序列與國(guó)內(nèi)外其他對(duì)應(yīng)序列相比有5個(gè)獨(dú)特的核苷酸突變，第96位（G→T）、136位（T→C）、317位（T→C）、943位（G→C）、1 052位（G→A），另外，還有6處突變與2012年之后國(guó)內(nèi)分離株普遍存在的突變位點(diǎn)相同，分別是142－144位GAC插入，161位G→A，228位C→A，1 343位G→A，1 487－1 490位ACG插入，1 535位G→A。核苷酸序列相似性分析結(jié)果表明Mink 1株與其他毒株gE基因相似性為97.1%～99.4%，與XiangA株和ZM株相似性最高，為99.4%。Mink 1株和部分2012年新分離的毒株位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中，而與以前分離的毒株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖5。

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis

3 討 論

本研究通過(guò)采集疑似偽狂犬病水貂病料，將PCR檢測(cè)陽(yáng)性病料接種MDCK細(xì)胞，并通過(guò)電鏡形態(tài)和免疫熒光觀察，初步證實(shí)從發(fā)病水貂腦組織中分離出1株P(guān)RV野毒株。將經(jīng)蝕斑純化后的病毒液接種家兔，試驗(yàn)組家兔在接種病毒后出現(xiàn)明顯的偽狂犬癥狀，皮膚瘙癢，用嘴啃咬注射部位，興奮不安，繼而出現(xiàn)四肢麻痹，最終角弓反張死亡。

由于目前缺乏對(duì)貂偽狂犬病的詳細(xì)描述資料，該病常被誤診為鏈球菌性腦炎、犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎。PRV基因組GC含量高達(dá)70%，設(shè)計(jì)檢測(cè)病毒的PCR引物難度較大，有時(shí)造成檢測(cè)樣品不夠敏感，確診該病最有力的證據(jù)仍是分離獲得病毒。在病料的檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)腦組織的病毒含量高，應(yīng)盡量以發(fā)病貂的腦組織作為檢測(cè)材料。

對(duì)gE基因的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Mink 1分離毒株gE基因與國(guó)內(nèi)外其他豬源參考毒株gE基因相似性在97%以上，與2012年新近分離的豬源偽狂犬病毒株遺傳關(guān)系近，位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中，與以前分離的毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。盡管這些病毒株能否形成一個(gè)新的流行毒株群還有待更多的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。但可以推斷，當(dāng)前本地區(qū)流行的貂源PRV可能由豬源PRV變異毒株而來(lái)，這與對(duì)犬的相關(guān)報(bào)道相似［10］。序列突變分析顯示，Mink 1同時(shí)存在142—144位GAC和1 487—1 490位ACG兩處特征性插入，并在1 535位、161位、228位等11處發(fā)生點(diǎn)突變。這些插入或點(diǎn)突變是否與病毒毒力增強(qiáng)有關(guān)，其功能有待進(jìn)一步研究。此外，除gE基因外的其他PRV基因是否發(fā)生了更多突變，從而使其得以在不同宿主間傳播也需要更進(jìn)一步的研究探索。

近年來(lái)，偽狂犬病病毒呈現(xiàn)變異速度加快、毒力增強(qiáng)、跨種感染增多的趨勢(shì)。在狐、貉、貂等毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)較密集的區(qū)域，大量出現(xiàn)偽狂犬病臨床癥狀為主要表現(xiàn)的病癥，且呈暴發(fā)流行趨勢(shì)。據(jù)病史調(diào)查，病獸既有生食豬、牛、羊等動(dòng)物產(chǎn)品的病史，也有無(wú)生食動(dòng)物產(chǎn)品病史；有的毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)毗鄰豬場(chǎng)，有的距離養(yǎng)豬場(chǎng)較遠(yuǎn)，因此，感染途徑除了經(jīng)消化道感染以外，不排除通過(guò)空氣傳播豬源PRV的可能性。因此，毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)距離豬場(chǎng)較遠(yuǎn)些，平時(shí)要做好隔離消毒措施。同時(shí)要加強(qiáng)豬偽狂犬病的防疫，是有效防控毛皮動(dòng)物偽狂犬病的重要措施。

4 結(jié) 論

首次報(bào)道從發(fā)病水貂中分離鑒定PRV，并對(duì)其gE基因序列進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)電鏡形態(tài)、免疫熒光觀察，以及PCR檢測(cè)證實(shí)分離到病毒，命名為 Mink 1。gE基因進(jìn)化分析表明，該毒株與2012年以來(lái)豬偽狂犬變異株的相似性高達(dá)99.4%，位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。

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