劉健鋒，丁艷平，伍志偉，王建林，邵寶平*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物學(xué)與發(fā)育生物學(xué)研究所，蘭州 730000；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)學(xué)院 系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所，蘭州 730020)

牦牛AQP9基因CDS全長序列克隆及其生物信息學(xué)特征分析

劉健鋒1，丁艷平2，伍志偉3，王建林1，邵寶平1*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物學(xué)與發(fā)育生物學(xué)研究所，蘭州 730000；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)學(xué)院 系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所，蘭州 730020)

為了研究高原動(dòng)物對青藏高原極端生境的適應(yīng)機(jī)理，并為探討高原動(dòng)物適應(yīng)機(jī)制提供基本數(shù)據(jù)。本研究運(yùn)用基因克隆技術(shù)對牦牛腦AQP9基因CDS全長序列進(jìn)行克隆，采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，AQP9基因和編碼序列特征進(jìn)行了以下幾方面的預(yù)測和分析：其物化性質(zhì)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，牦牛AQP9的CDS含有一個(gè)885 bp的開放閱讀框，編碼295個(gè)氨基酸；牦牛AQP9基因編碼蛋白分子量和理論等電點(diǎn)分別為31.89 ku和6.21，其編碼蛋白含有6次跨膜結(jié)構(gòu)，屬于疏水性蛋白；二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊及無規(guī)則卷曲構(gòu)成；牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列與黃牛、藏羚羊、綿羊等物種間同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化情況與其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近一致。本研究將為牦牛低氧適應(yīng)性研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

牦牛；AQP9基因；CDS區(qū)；分子克??；生物信息學(xué)

AQP9(水通道蛋白9，AQP9)是水通道蛋白家族第二亞類水甘油通道蛋白(包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10)的成員之一[1]。1997年，H.Kuriyama等[2]在進(jìn)行人類脂肪組織基因序列系統(tǒng)分析過程中首次發(fā)現(xiàn)AQP9。近年的研究表明，AQP9可以透過嘌呤(腺嘌呤)、嘧啶(尿嘧啶和化學(xué)療法中使用的氟尿嘧啶)及一元羧酸(乳酸和β-羥基丁酸)[3-4]；AQP9對一元羧酸，比如乳酸和β-羥基丁酸的通透效率與體內(nèi)pH相關(guān)，尤其在pH為5.5時(shí)通透性急劇增加[3]；AQP9還可以促進(jìn)砷類金屬的運(yùn)輸，這表明AQP9可能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取亞砷酸鹽的主要途徑[5]。AQP9主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和兒茶酚胺能神經(jīng)元細(xì)胞膜上[6]，而兒茶酚胺神經(jīng)元的電位活動(dòng)在甘油和乳酸濃度上升時(shí)會(huì)被改變，包括攝食行為的最終改變。綜上所述，除水分子外，AQP9對尿素、甘油、多元醇、乳酸等多種小分子溶質(zhì)均有通透性，可參與組織中水的轉(zhuǎn)運(yùn)、水電解質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)、滲透壓的感知及能量代謝等[6-11]。

缺氧是引發(fā)眾多類型腦疾病，尤其是腦水腫發(fā)生、發(fā)展的重要因子。腦是機(jī)體適應(yīng)其棲息地進(jìn)行生存、生產(chǎn)及繁衍的“指令中樞”，又是對環(huán)境氧最敏感的器官。腦神經(jīng)細(xì)胞作為進(jìn)化最古老的細(xì)胞，“水和能量的代謝”在維持其正常生理功能中發(fā)揮了非常重要的生理作用。大量研究表明低氧可上調(diào)AQP9蛋白的表達(dá)且AQP9的表達(dá)與腦水腫程度呈正相關(guān)[1，7，10，12-13]。牦牛作為體型最大、運(yùn)動(dòng)劇烈且好動(dòng)的半野生動(dòng)物，其對高寒、低氧極端生境的適應(yīng)早已引起國內(nèi)外廣大學(xué)者的關(guān)注[14-15]。但是，到目前為止，在國內(nèi)外還尚未見到有關(guān)“牦牛腦AQP9基因CDS全長序列及其相關(guān)生物信息學(xué)特征”的研究報(bào)道。本研究運(yùn)用基因克隆、表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及生物信息學(xué)分析等技術(shù)和方法，對牦牛AQP9基因進(jìn)行了CDS全長序列克隆及生物信息學(xué)特征分析。本研究結(jié)果將為明晰高原動(dòng)物對青藏高原高寒、低氧等極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理，進(jìn)一步探討高原動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞在其極端生境中水和能量代謝的分子機(jī)理，以及為人類高原疾病的預(yù)防和治療研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為健康成年甘南牦牛(3～4歲，體重約225 kg，海拔>3 400 m)。試驗(yàn)材料采于甘肅省甘南州瑪曲縣屠宰場，在動(dòng)物屠宰后，立即取其頭沿矢狀面開顱取腦，用無菌生理鹽水將腦快速?zèng)_洗干凈后剪成小塊迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃超低溫冰箱長期保存。

1.2 分子生物學(xué)試劑

Trizol試劑、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DL5000 DNA marker、DL2000 DNA marker、E.coliDH5ɑ、DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR I和KpnI及質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Kan抗生素、DNase I和DEPC購自Sigma公司(美國)，pEGFP-C1載體和感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛大腦皮質(zhì)總RNA的提取 采用Trizol法提取大腦皮質(zhì)總RNA，DNase I去除基因組中殘留的DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的質(zhì)量，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中黃牛AQP9基因cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物P1和P2，即P1：5′-GGAATTCATGCAGCCTGAGATGGA-ACAAA-3′；P2：5′-GGGGTACCTTACATGATT-GCATTCAGTTCATATTT-3′，橫線部分分別為EcoR I和KpnI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列。擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增 以牦牛大腦皮質(zhì)總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體系10 μL：5×PrimeScript Buffer 2 μL，RNase free dH2O 7 μL，500 ng·μL-1總RNA 1 μL，混勻后，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將產(chǎn)物4 ℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，P1、P2為引物，擴(kuò)增AQP9基因。PCR反應(yīng)體系25 μL：5×Prime Star Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS 0.25 μL，cDNA模板1 μL，RNase-Free dH2O 15.75 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用l%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，用DNA片段回收試劑盒對PCR產(chǎn)物回收。

1.3.4AQP9基因的克隆 回收的PCR產(chǎn)物在T4 連接酶的作用下與pEGFP-C1載體進(jìn)行過夜連接12～16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5ɑ中，37 ℃，100 r·min-1培養(yǎng)1 h，涂于含有Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取陽性單克隆接種于含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r·min-1過夜培養(yǎng)。用“質(zhì)粒提取試劑盒”提取質(zhì)粒后用EcoR I和KpnI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定成功后將質(zhì)粒送往上海生工公司進(jìn)行測序。1.3.5 生物信息學(xué)分析AQP9基因開放閱讀框(ORF)采用NCBI的ORF Finder程序分析，序列比對及同源性分析使用DNAMAN軟件及在線NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)；蛋白質(zhì)特性預(yù)測使用Bioedit及Lasergene7.1軟件包中的Protean軟件；親水性疏水性預(yù)測采用Epasy服務(wù)器上的protscale程序(http：//web.expasy.org/protscale/)；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用法國里昂CNRS的SOPMA軟件(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)，并利用SWISS-MODEL軟件(http：//swiss-model.expasy.org/)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，置信度用Boot-strap檢驗(yàn)(重復(fù)次數(shù)為1 000)。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛AQP9基因的PCR擴(kuò)增

牦牛大腦皮層總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測到28S、18S和5S 3條帶(圖略)，OD260 nm/OD280 nm平均為1.95，表明RNA完整性較好，沒有蛋白質(zhì)或DNA污染，且純度和濃度適合RT-PCR。經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，DNA片段在1 000 bp左右，可能還含有編碼區(qū)兩側(cè)序列，與預(yù)期DNA片段(885 bp)大小并不矛盾，條帶清晰且特異性良好，可以進(jìn)行切膠回收進(jìn)一步做克隆。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA marker;1-3. PCR products圖1 AQP9基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 The PCR amplification of AQP9 gene

2.2 牦牛AQP9基因克隆及重組子的鑒定

提取菌液的質(zhì)粒并用EcoR I和KpnI內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到一條約5 000 bp的pEGFP-C1線性片段和約900 bp的插入片段(圖2)，與預(yù)期相符。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒的雙酶切片段M.DNA marker;1.Recombinant plasmid digested by double digestion圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid

2.3 牦牛AQP9基因的序列測定及分析

將雙酶切鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送往上海生工公司測序。測序結(jié)果表明，克隆得到的序列在NCBI上進(jìn)行同源性搜索，所得到的目的基因?yàn)殛笈QP9編碼區(qū)全長(CDS)，為885 bp，編碼295個(gè)氨基酸，其中3個(gè)半胱氨酸(Cys)。應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序?qū)﹃笈QP9基因序列開放閱讀框分析，分析表明AQP9基因含有一個(gè)長度為885 bp的開放閱讀框，編碼295個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖3)。

2.4 牦牛AQP9蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 牦牛AQP9蛋白的理化性質(zhì) 運(yùn)用Protparam軟件分析了牦牛AQP9蛋白的基本理化性質(zhì)，其分析表明：蛋白分子量為31 892.4 u，理論等電點(diǎn)為6.21；含有20種基本氨基酸，其中含量最高的是Ala(11.5%)，含量最低的是Cys(1.0%)；有帶負(fù)電荷的殘基23個(gè)，帶正電荷的殘基20個(gè)；280 nm的摩爾消光系數(shù)為34 045 mol·cm-1；蛋白的平均親水系數(shù)為0.569。2.4.2 牦牛AQP9蛋白的親水性/疏水性 運(yùn)用Expasy服務(wù)器中ProtScale程序?qū)﹃笈QP9的親水性/疏水性進(jìn)行了分析，如圖4所示，第160位異亮氨酸(Ile)疏水性最強(qiáng)(最高分值3.800)；第271位組氨酸(His)親水性最強(qiáng)(最低分值為-3.2)。

圖3 牦牛AQP9基因的堿基和氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and amino acid sequences of yak AQP9 gene

圖4 牦牛AQP9蛋白疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophobicity of yak AQP9 protein

2.4.3 牦牛AQP9蛋白的跨膜區(qū)分析 運(yùn)用TMHMM server 2.0分析表明，如圖5所示，該蛋白為6次跨膜蛋白，即1～26位氨基酸為胞內(nèi)部分；27～49氨基酸為第1個(gè)跨膜螺旋；50～58氨基酸在胞外；59～81氨基酸為第2個(gè)跨膜螺旋；82～101為胞內(nèi)部分；102～124為第3個(gè)跨膜螺旋；125～157為胞外部分；158～180為第4個(gè)跨膜螺旋；181～192為胞內(nèi)部分；193～215為第5個(gè)跨膜螺旋；216～242為胞外部分；243～265為第6個(gè)跨膜螺旋；266～295為胞內(nèi)部分。

圖5 牦牛AQP9蛋白跨膜區(qū)域Fig.5 Transmembrane region of yak AQP9 protein

2.4.4 牦牛AQP9蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 如圖6所示，運(yùn)用SOPMA服務(wù)器分析表明，牦牛AQP9的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸、β-折疊及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，其各種結(jié)構(gòu)所占比例分別是38.18%、24.32%、4.73%及32.77%，其中α-螺旋主要分布在位于細(xì)胞內(nèi)的氨基酸兩端。運(yùn)用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，如圖7所示，牦牛AQP9蛋白的三級結(jié)構(gòu)也是由α-螺旋、延伸、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖6 牦牛AQP9蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of yak AQP9 protein

2.4.5 牦牛AQP9蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫中收集下載7個(gè)物種的AQP9基因編碼蛋白序列，采用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)牦牛AQP9基因編碼蛋白與其他物種AQP9基因編碼蛋白具有較高的同源性，牦牛AQP9氨基酸序列與黃牛、藏羚羊、綿羊、野豬、野駱駝、人、及狼的同源性分別為99.8%、97.1%、96.7%、89.6%、88.2%、87.6%及87.5%。用NJ法構(gòu)建了上述8個(gè)物種AQP9的基因系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖8所示，牦牛與黃牛、藏羚羊及綿羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。

3 討 論

隨著人類基因組測序工作的基本完成，基因組學(xué)的研究從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)過渡到了功能基因組學(xué)[16]。cDNA的測序已成為人們了解編碼基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵所在。生物信息技術(shù)為試驗(yàn)研究提供了重要的線索，對隨后的研究起到了“事半功倍”的作用。隨著基因組序列信息的日益豐富，計(jì)算方法和數(shù)據(jù)庫的不斷完善，生物信息學(xué)將在基因全長cDNA克隆和分析中扮演更加重要的角色。1988年，B.M.Denker首先從哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)28 ku的疏水性跨膜蛋白[17]。1991年G.M.Preston等[18]完成了第一個(gè)水通道蛋白cDNA的分子克隆和功能鑒定，證明了哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上有可以特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域的發(fā)展。迄今為止，在哺乳動(dòng)物組織中已發(fā)現(xiàn)13種AQP (AQP0-AQP12)。AQPs的發(fā)現(xiàn)對生物有機(jī)體內(nèi)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)機(jī)制的研究及臨床代謝類障礙疾病病理的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)和治療，具有劃時(shí)代的意義。

圖7 牦牛AQP9蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.7 Putative tertiary structure of yak AQP9 protein

圖8 NJ法構(gòu)建的AQP9基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.8 Phylogenetic tree of AQP9 gene by NJ method

表1 牦牛與其他7個(gè)物種AQP9的氨基酸序列同源性比較

本研究克隆得到的牦牛AQP9基因編碼區(qū)序列具有特定的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，是牦牛AQP9基因編碼區(qū)全長序列，編碼AQP9蛋白。牦牛AQP9基因含有一個(gè)長度為885 bp的開放閱讀框，編碼295個(gè)氨基酸。通過對牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明，肽鏈中含有6個(gè)串聯(lián)的疏水跨膜區(qū)，且這些跨膜區(qū)富含α-螺旋，缺少β-折疊結(jié)構(gòu)，這與水通道蛋白家族其他成員結(jié)構(gòu)相似[19]。該蛋白具有水通道蛋白家族保守的序列特征，其二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸、β-折疊以及無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)模式組成，且α-螺旋和無規(guī)則卷曲分別占33.18%和24.32%，這與其他AQPs結(jié)構(gòu)相似[19]。牦牛AQP9基因編碼氨基酸序列中含有兩個(gè)天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)結(jié)構(gòu)，NPA為AQP家族共有的特征結(jié)構(gòu)，這與G.M.Preston等[18]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，且這兩個(gè)NPA序列在空間上圍繞通道中軸呈點(diǎn)對稱分布。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律可知，AQP9蛋白整體疏水性較強(qiáng)，僅兩端膜內(nèi)的部分氨基酸具有較好的親水性。同源建模結(jié)果表明，牦牛AQP9蛋白的高級結(jié)構(gòu)是由相同的4個(gè)亞基組成的同源四聚體，這與鼠的高級結(jié)構(gòu)類似[20]。

序列同源性在一定程度上反映物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。通過序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，牦牛AQP9蛋白與其他物種AQP9蛋白具有較高的同源性，這與物種進(jìn)化的結(jié)果相一致，表明AQP9基因可能是由同一個(gè)祖先基因進(jìn)化而來，同時(shí)也反映了AQP9蛋白在不同物種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對生物體功能的重要性。盡管牦牛和黃牛AQP9蛋白氨基酸序列間同源性很高，但還是存在兩個(gè)氨基酸的差異。另外，大量研究表明，在腦神經(jīng)細(xì)胞中AQP9蛋白同時(shí)參與水和能量代謝最重要的膜通道蛋白[1，7，10，12-13]；而且，AQP9蛋白還在腦水腫的發(fā)生、發(fā)展及其清除過程中也發(fā)揮著重要作用[13，21-22]。由此推測，在青藏高原極端低氧環(huán)境中，AQP9蛋白在牦牛腦神經(jīng)細(xì)胞的水和能量代謝及其高原腦水腫抗性的調(diào)控中發(fā)揮中非常重要的作用，但其具體調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究利用分子克隆手段獲得牦牛AQP9基因的編碼區(qū)序列并首次通過生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法發(fā)現(xiàn)該蛋白含有六次跨膜結(jié)構(gòu)，屬于疏水性蛋白；二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸、β-折疊及無規(guī)則卷曲構(gòu)成；牦牛AQP9蛋白與黃牛、藏羚羊、綿羊等物種間同源性較高，本研究將為牦牛低氧適應(yīng)性研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

[1] BADAUT J.Aquaglyceroporin 9 in brain pathologies[J].Neuroscience，2010，168：1047-1057.

[2] KURIYAMA H，KAWAMOTO S，ISHIDA N，et al.Molecular cloning and expression of a novel human aquaporin from adipose tissue with glycerol permeability[J].BiochemBiophysicResCommun，1997，241：53-58.

[3] TSUKAGUCHI H，SHAYAKUL C，BERGER U V，et al.Molecular characterization of a broad selectivity neutral solute channel[J].JBiolChem，1998，273：24737-24743.

[4] TSUKAGUCHI H，WEREMOWICZ S，MORTON C C，et al.Functional and molecular characterization of the human neutral solute channel aquaporin-9[J].AmJPhysiol，1999，277：F685-696.

[5] LIU Z，SHEN J，CARBREY J M，et al.Arsenite transport by mammalian aquaglyceroporins AQP7 and AQP9[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99：6053-6058.

[6] BADAUT J，PETIT J M，BRUNET J F，et al.Distribution of Aquaporin 9 in the adult rat brain：preferential expression in catecholaminergic neurons and in glial cells[J].Neuroscience，2004，128：27-38.

[7] BADAUT J，REGLI L.Distribution and possible roles of aquaporin 9 in the brain[J].Neuroscience，2004，129：969-979.

[8] WARTH A，MITTELBRONN M，HULPER P，et al.Expression of the water channel protein aquaporin-9 in malignant brain tumors[J].ApplImmunohistochemMolMorphol，2007，15：193-198.

[9] DIBAS A，YANG M H，BOBICH J，et al.Stress-induced changes in neuronal Aquaporin-9 (AQP9) in a retinal ganglion cell-line[J].PharmacolRes，2007，55：378-384.

[10] BADAUT J，HIRT L，GRANZIERA C，et al.Astrocyte-specific expression of aquaporin-9 in mouse brain is increased after transient focal cerebral ischemia[J].JCerebBloodFlowMetab，2001，21：477-482.

[11] ZELENINA M.Regulation of brain aquaporins[J].NeurochemInt，2010，57：468-488.

[12] BADAUT J，BRUNET J F，REGLI L.Aquaporins in the brain：from aqueduct to “multi-duct”[J].MetabBrainDis，2007，22：251-263.

[13] 邵寶平，余華晟，王建林.AQP9在腦疾病中的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(1)：87-91. SHAO B P，YU H S，WANG J L.Progress on Aquaglyceroporin 9 in Brain Pathologies[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2012，33(1)：87-91.(in Chinese)

[14] HAN X T，HAN X T，XIE A Y，et al.Effects of high altitude and season on fasting heat production in the yakBosgrunniensorPoephagusgrunniens[J].BrJNutr，2002，88：189-197.

[15] SHAO B，LONG R，DING Y，et al.Morphological adaptations of yak (Bosgrunniens) tongue to the foraging environment of the Qinghai-Tibetan plateau[J].JAnimSci， 2010，88：2594-2603.

[16] KIM S K.Functional genomics：the worm scores a knockout[J].CurrBiol，2001，11：R85-87.

[17] DENKER B M，SMITH B L，KUHAJDA F P，et al.Identification，purification，and partial characterization of a novel Mr 28 000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules[J].JBiolChem，1988，263：15634-15642.

[18] PRESTON G M，AGRE P.Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons：member of an ancient channel family[J].ProcNatlAcadSciUSA，1991，88：11110-11114.

[19] MOON C，PRESTON G M，GRIFFIN C A，et al.The human aquaporin-CHIP gene.Structure，organization，and chromosomal localization[J].JBiolChem，1993，268：15772-15778.

[20] SUZUKI M，TANAKA S.Structure and diverse functions of vertebrate aquaporins[J].Seikagaku，2014，86：41-53.

[21] ROJEK A M，SKOWRONSKI M T，F(xiàn)UCHTBAUER E M，et al.Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice[J].ProcNatlAcadSciUSA，2007，104：3609-3614.

[22] HIGASHIDA T，PENG C，LI J，et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha contributes to brain edema after stroke by regulating aquaporins and glycerol distribution in brain[J].CurrNeurovascRes，2011，8：44-51.

(編輯 郭云雁)

Cloning and Bioinformatics Analysis of the CDS of YakAQP9 Gene

LIU Jian-feng1，DING Yan-ping2，WU Zhi-wei3，WANG Jian-lin1，SHAO Bao-ping1*

(1.InstituteofZoologyandDevelopmentalBiology,SchoolofLifeSciences，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China；2.SchoolofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，China；3.InstituteofSystemsBiologyandTCMTransformation，GansuTraditionalChineseMedicalCollege，Lanzhou730020，China)

The aim of this study was to investigate the adaption mechanism of plateau animals to extreme environment of the Qinghai-Tibet plateau，and to provide some basic data for exploring the adaption mechanism of plateau animals.The coding region sequence of yakAQP9 was cloned by molecular cloning technique and analyzed by bioinformatics in this study.Some characteristics of theAQP9 gene and encoded protein sequences were predicted and analyzed in the following aspects as the general physical and chemical properties，hydrophobicity，transmembrane structure and secondary structure.The results showed that the CDS of yakAQP9 contains a complete ORF (885 bp) encoding 295 amino acids.The putative molecular weight and theory isoelectric point ofAQP9 gene coding protein in yak were 31.89 ku and 6.21，respectively.The protein encoded by yakAQP9 contains 6 transmembrane domains，and it was a hydrophobic protein.The secondary structures are mainly composed of α-helix，extended strand，β-turn and random coil.Deduced amino acid sequences ofAQP9 gene between yak and cattle，sheep and other species were high homology，and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship.This study will provide certain basic data for studying hypoxia adaptation of yak.

yak；Aquaporin9(AQP9)；gene；CDS region；molecular cloning；bioinformatics

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.008

2014-08-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(青年基金：31000190；地區(qū)基金：31060141)；蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)

劉健鋒(1988-)，男，重慶忠縣人，碩士生，主要從事高原動(dòng)物適應(yīng)性機(jī)理研究，E-mail：andyandhope@gmail.com

*通信作者：邵寶平，博士，副教授，碩導(dǎo)，主要從事高原動(dòng)物適應(yīng)性機(jī)理研究，E-mail：shaobp@lzu.edu.cn

S823.8+5.2

A

0366-6964(2015)07-1134-07