羅思思，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，黃嬌玲，曾婷婷

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

H7亞型和N9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立

羅思思，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，黃嬌玲，曾婷婷

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，建立一種H7亞型和N9亞型禽流感病毒(AIV)可視化快速檢測方法。根據(jù)GenBank中H7亞型和N9亞型AIVHA和NA基因序列，在其保守區(qū)域設(shè)計篩選出H7亞型和N9亞型AIV的特異性LAMP引物各一套，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立能檢測H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP方法，并進(jìn)行特異性和敏感性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，該法用實(shí)時濁度儀63 ℃反應(yīng)1 h，能特異性地檢測H7亞型和N9亞型AIV，而對其他15個H亞型和8個N亞型的AIV和禽類呼吸道病原體均無擴(kuò)增，最低能檢出10 拷貝·μL-1目的基因。所建立的H7亞型和N9亞型RT-LAMP方法特異性強(qiáng)、敏感性高，結(jié)果可視化，操作簡便、快速，為H7、N9和H7N9亞型AIV的有效防控提供技術(shù)支撐，具有較好的應(yīng)用前景。

H7亞型禽流感病毒；N9亞型禽流感病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；可視化檢測

根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的差異，A型流感病毒分為不同亞型，目前已鑒定出17種HA亞型(H1～H17)和10種NA亞型(N1～N10)[1-2]。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，已發(fā)現(xiàn)H5N1、H5N2、H5N6、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H10N8等亞型AIV可跨越種屬屏障直接感染人[3-9]。2013年3月底在上海和安徽等地率先發(fā)現(xiàn)H7N9亞型AIV感染人的病例，這是全球首次發(fā)現(xiàn)H7N9感染并致死人的病例，引起了全世界的關(guān)注。2013—2014年陸續(xù)在我國浙江、上海、江蘇和河南等省市發(fā)現(xiàn)了H7N9亞型AIV。因此，檢測H7亞型和N9亞型AIV具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由T.Notomi等[10]在2000年發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用內(nèi)、外和環(huán)3對引物，針對病原的8個靶序列區(qū)域，加上Bst DNA聚合酶進(jìn)行核酸變性和自動循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)。由于3對引物同時擴(kuò)增，所以LAMP擴(kuò)增效率很高。針對RNA病毒檢測，可在LAMP反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，直接以RNA作為檢測模板，在60 ℃左右等溫條件下，即可同時進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和LAMP擴(kuò)增，一步就可完成RT-LAMP的檢測。目前，LAMP技術(shù)在動物病原體的檢測中得到廣泛應(yīng)用[11-14]，本研究旨在建立一種能檢測鑒別H7亞型和N9亞型AIV的RT-LAMP檢測方法，為H7亞型和N9亞型AIV的快速診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用31株AIV毒株(包括H1～H16亞型和N1～N9亞型，其中，H5和H7亞型AIV為廣西壯族自治區(qū)疫病控制中心等惠贈的RNA)和3株常見禽病毒株(包括新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒)，為廣西獸醫(yī)研究所分離保存或香港大學(xué)等惠贈，具體見“結(jié)果”部分病原/分離株列表。MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑購自大連寶生物公司；RNA純化試劑盒購自QIAGEN公司；pGEM-T Easy載體和RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promaga公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司。

1.2 LAMP引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公開的H7亞型和N9亞型AIVHA和NA基因序列，用DNAStar軟件比對序列，使用在線軟件Primer Explorer V4 ( http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計篩選出針對H7亞型和N9亞型AIV LAMP引物各3套，經(jīng)NCBI比對驗(yàn)證，確保引物的特異性。引物合成后，通過引物可行性預(yù)試驗(yàn)，從中再篩選出H7亞型和N9亞型LAMP引物各一套，為了提高H7亞型的敏感性，在F1c和B1c之間設(shè)計了一條加速引物AP。H7亞型和N9亞型AIV的LAMP引物序列如表1所示，引物由廣州Invitrogen公司合成。

表1 H7亞型和N9亞型AIV的RT-LAMP引物序列

1.3 核酸的提取

按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0抽提試劑盒說明書，提取不同亞型AIV(除H5和H7亞型AIV外)、新城疫病毒(NDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)的RNA，提取傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的DNA。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用表1中H7-F3、H7-B3和N9-F3、N9-B3兩對引物對H7N9亞型AIV RNA RT-PCR擴(kuò)增HA基因和NA基因的目的片段，將其PCR產(chǎn)物連入含有T7啟動子的pGEM-T Easy克隆載體，挑取陽性克隆菌測序驗(yàn)證。提取測序正確的質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶SpeI酶切，使克隆載體線性化，按照RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，使質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為體外RNA，用RNA純化試劑盒，純化體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段。利用NanoDrop ND-1000微量核酸檢測儀檢測所轉(zhuǎn)錄RNA濃度，根據(jù)相對分子質(zhì)量和核酸濃度計算拷貝數(shù)。將體外轉(zhuǎn)錄的H7亞型和N9亞型AIV RNA目的片段梯度稀釋至105～1拷貝·μL-1，各取1 μL作為模板，用于敏感性的測定。

1.5 RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)LAMP報道和本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，反應(yīng)條件具體需優(yōu)化溫度以及甜菜堿(Betaine)、硫酸鎂(MgSO4)和dNTPs三種反應(yīng)試劑，反應(yīng)溫度在58～67 ℃間摸索，試劑在終濃度為0.2～1.6 mol·L-1Betaine、1～6 mmol·L-1MgSO4和0.2～1.6 mmol·L-1dNTPs范圍進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 敏感性試驗(yàn)

按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件，對體外轉(zhuǎn)錄濃度為105～1拷貝·μL-1H7亞型和N9亞型AIV RNA進(jìn)行H7亞型和N9亞型RT-LAMP檢測，檢驗(yàn)其敏感性。此外，在H7亞型AIV RT-LAMP試驗(yàn)中，對添加AP引物和不用AP引物的反應(yīng)體系進(jìn)行平行試驗(yàn)，分析其敏感性差異。

1.7 特異性試驗(yàn)

按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件，對不同HA(H1～H16)、NA (N1～N9)亞型AIV和禽類常見呼吸道疾病(NDV、IBV和ILTV)進(jìn)行檢測，驗(yàn)證H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP特異性。

1.8 RT-LAMP的初步應(yīng)用

利用所建立的H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP方法對134份臨床樣品進(jìn)行檢測，其中，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)趙繼勛教授提供的經(jīng)分離鑒定為H7N9亞型AIV雞組織懸液(喉氣管、肝、肺、腦)的RNA樣品5份，美國賓夕法尼亞大學(xué)提供的經(jīng)分離鑒定為H7N2(9份)、H11N9(6份)亞型AIV 家禽咽肛棉拭子的RNA樣品共15份，本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)分離鑒定為AIV(H1、H3、H4、H6、H9)、NDV、IBV、ILTV的咽肛棉拭子樣品(采集于活禽市場)共114份。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對反應(yīng)溫度的摸索，結(jié)果顯示在溫度范圍為61～65 ℃時，擴(kuò)增效率較好，最終確定該法最佳反應(yīng)溫度為63 ℃。通過對反應(yīng)試劑的優(yōu)化，25 μL RT-LAMP反應(yīng)體系具體如下：1 μL引物預(yù)混液(包括FIP和BIP濃度為40 μmol·L-1、B3和F3濃度為5 μmol·L-1、LF和LB濃度為20 μmol·L-1)、1 μL 8 U·μL-1Bst DNA聚合酶、2.5 μL 10×Bst buffer、1 μL 5 U·μL-1AMV反轉(zhuǎn)錄酶、3.5 μL 10 mmol·L-1dNTPs、4.0 μL 5 mol·L-1Betaine、5.0 μL 25 mmol·L-1MgSO4、1.0 μL 625.0 μmol·L-1Calcein、1.0 μL 12.5 mmol·L-1MnCl2、2.0 μL RNA模板，其余以超純水補(bǔ)足。充分混勻反應(yīng)體系后，置于實(shí)時濁度儀63 ℃反應(yīng)1 h，80 ℃作用5 min終止反應(yīng)。

2.2 敏感性試驗(yàn)

所建立的H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP的最低檢測限均為10 拷貝·μL-1(圖1和2)，對濃度為105～10 拷貝·μL-1的H7亞型和N9亞型AIV RNA檢測為陽性，濁度儀擴(kuò)增生成典型的S型擴(kuò)增曲線，同時，反應(yīng)液變翠綠色；對濃度為1 拷貝·μL-1的H7亞型和N9 亞型AIV RNA檢測為陰性，生成直線，反應(yīng)液仍為桔黃色。此外，缺少AP引物的H7亞型 AIV RT-LAMP的最低檢測限為102拷貝·μL-1。

1.105拷貝·μL-1；2.104拷貝·μL-1；3.103 拷貝·μL-1；4.102拷貝·μL-1；5.10 拷貝·μL-1；6.1拷貝·μL-1；7.陰性對照1.105 copies·μL-1；2.104 copies·μL-1；3.103 copies·μL-1；4.102 copies·μL-1；5.10 copies·μL-1；6.1 copy·μL-1；7.Negative control圖1 H7 RT-LAMP敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Sensitivity results of H7 RT-LAMP

1.105拷貝·μL-1；2.104拷貝·μL-1；3.103拷貝·μL-1；4.102拷貝·μL-1；5.10 拷貝·μL-1；6.1拷貝·μL-1；7.陰性對照1.105 copies·μL-1；2.104 copies·μL-1；3.103 copies·μL-1；4.102 copies·μL-1；5.10 copies·μL-1；6.1 copy·μL-1；7.Negative control圖2 N9 RT-LAMP敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity results of N9 RT-LAMP

2.3 特異性試驗(yàn)

H7亞型AIV RT-LAMP檢測結(jié)果見圖3，H7N9和H7N7 RNA的檢測結(jié)果為陽性，可見明顯的S型濁度曲線，而對其他HA亞型AIV的檢測均為陰性，檢測結(jié)果為直線；N9亞型RT-LAMP檢測結(jié)果見圖4，只有H7N9和H11N9 RNA為陽性結(jié)果，可見明顯的S型濁度曲線，而對其他NA亞型AIV的檢測均為陰性，檢測結(jié)果為直線。Calcein指示劑法(圖略)和實(shí)時濁度監(jiān)控結(jié)果一致。此外，用該法對更多毒株的檢測結(jié)果見表2，表明所建立的 RT-LAMP檢測方法特異性擴(kuò)增H7亞型和N9亞型AIV，而對其他HA和NA亞型AIV不發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.H7N9；2.H7N7；3.H1N2；4.H2N3；5.H3N2；6.H4N6；7.H5N9；8.H6N6；9.H8N4；10.H9N8；11.H10N7；12.H11N9；13.H12N5；14.H13N5；15.H14N5；16.H15N9；17.H16N3；18.Negative control圖3 H7 RT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity results of H7 RT-LAMP

1.H7N9；2.H11N9；3.H5N1；4.H1N2；5.H2N3；6.H8N4；7.H12N5；8.H4N6；9.H10N7；10.H9N8；11.Negative control圖4 N9 RT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity results of N9 RT-LAMP

2.4 RT-LAMP的初步應(yīng)用

應(yīng)用所建立的H7亞型RT-LAMP方法對5份H7N9亞型AIV和9份H7N2亞型AIV臨床樣品的RNA檢測結(jié)果均為陽性；應(yīng)用建立的N9亞型RT-LAMP方法對5份H7N9亞型AIV 和6份H11N9亞型AIV臨床樣品的RNA檢測結(jié)果均為陽性；應(yīng)用所建立的H7、N9亞型AIV RT-LAMP方法分別對其他亞型AIV和常見的家禽呼吸道病原體的臨床樣品檢測結(jié)果均為陰性，具體結(jié)果見表3，與實(shí)際相符。

3 討 論

2013年3月，在中國首次發(fā)現(xiàn)H7N9亞型AIV感染和致死人的病例，引起全世界的關(guān)注。截至2014年11月2日，國內(nèi)至少有456份感染H7N9亞型AIV的病例，其中177例死亡。該亞型病毒感染一般表現(xiàn)為流感樣癥狀，重癥患者出現(xiàn)高熱、肺炎、呼吸窘迫和多器官障礙等癥狀，甚至死亡。此次感染的H7N9為重組病毒，突發(fā)性強(qiáng)，對人尚無有效的預(yù)防和治療措施，給公共衛(wèi)生安全帶來很大的危害，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)對H7N9監(jiān)測和診斷技術(shù)的研究，對該病的防控具有重要意義。目前，診斷AIV的方法中，病毒分離與鑒定方法是金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但檢測的周期較長，達(dá)不到快速檢測的要求。RT-PCR方法需接觸有害物DNA染色劑[15]；熒光定量RT-PCR方法可實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程，但熒光PCR儀器價格較昂貴，在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性[16]。因此，建立一種可視化、快速、特異、靈敏、易于操作與應(yīng)用的檢測方法對H7亞型和N9亞型AIV的防控具有重要意義。

表2 病原/分離株與H7亞型和N9亞型 RT-LAMP檢測結(jié)果

表3 RT-LAMP臨床檢測結(jié)果

可視化RT-LAMP作為新型核酸檢測技術(shù)，在動物傳染病病原體的檢測上，近幾年已有很多報道[17-23]。目前，已有H7N9禽流感病毒等溫擴(kuò)增快速檢測方法的報道[24]，但該報道使用傳統(tǒng)的LAMP反應(yīng)結(jié)果觀察方法，需在反應(yīng)結(jié)束后打開反應(yīng)管蓋，添加熒光染料SYBR Green來觀察反應(yīng)液顏色變化和觀察反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果有無特征性梯形條帶確定檢測結(jié)果。該結(jié)果判定方法較易使其產(chǎn)物形成氣溶膠導(dǎo)致LAMP陽性產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，造成下次檢測時出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本文與其不同之處在于，為了降低污染和假陽性，本研究在擴(kuò)增前預(yù)先加入指示劑鈣黃氯素，通過觀察反應(yīng)前后顏色變化判定結(jié)果，將該反應(yīng)體系置于實(shí)時濁度儀63 ℃恒溫作用，通過濁度值的變化實(shí)時監(jiān)測整個擴(kuò)增過程，能更清楚掌握擴(kuò)增進(jìn)程，使診斷結(jié)果更準(zhǔn)確，同時顏色變化和濁度值判定的結(jié)果一致，避免開蓋造成污染。此外，該報道只限于對H7N9亞型AIV進(jìn)行檢測，未見有對其他H7亞型和N9亞型AIV的驗(yàn)證檢測，而本研究所建立的RT-LAMP檢測方法的檢測范圍更廣，既能對H7N9亞型AIV進(jìn)行鑒別檢測，也能對H7N2、H7N7、H5N9和H11N9等不同HA和NA亞型搭配中的H7亞型和N9亞型AIV進(jìn)行鑒別診斷。

對于H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP的成功建立，作者認(rèn)為以下兩方面十分重要：首先，篩選基因保守序列，按照LAMP引物設(shè)計軟件提示的Tm值、GC含量和錯配等信息，設(shè)計特異性和擴(kuò)增效率高的LAMP引物，此外，本研究發(fā)現(xiàn)在H7內(nèi)引物F1c和B1c之間設(shè)計的加速引物AP能提高反應(yīng)的敏感度；其次，由于RT-LAMP擴(kuò)增效率很高，應(yīng)對操作區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)，如配制反應(yīng)液區(qū)、加RNA模板區(qū)和結(jié)果觀察區(qū)等，以免相互交叉污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果?？梢暬疪T-LAMP只需一臺可控溫的水浴鍋，特別有利于養(yǎng)殖場、鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站和現(xiàn)場的檢測應(yīng)用。

4 結(jié) 論

建立的H7亞型和N9亞型AIV RT-LAMP快速檢測鑒別方法特異性強(qiáng)、敏感性高，不需特殊的儀器，可對H7、N9和H7N9亞型AIV進(jìn)行快速鑒別檢測，具有簡便、快速和結(jié)果可視化的優(yōu)點(diǎn)，有助于H7、N9和H7N9亞型AIV的早期診斷，為該病的有效防控提供技術(shù)支持。

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(編輯 白永平)

Visual Detection of H7 and N9 Subtypes Avian Influenza Viruses by Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification Assay

LUO Si-si，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology，GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay was developed for rapid visual detection of H7 and N9 subtype avian influenza viruses (AIV).According to the conservative sequences of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes of H7 and N9 subtype AIV in GenBank，two sets of primers were designed，then the reaction conditions were optimized.The specificity and sensitivity of the RT-LAMP assay were evaluated.RT-LAMP amplification was completed in 1 h by incubating all of the reagents in a single tube by real-time turbidimeter at 63 ℃.The specific test demonstrated that the RT-LAMP assay was specific for detecting H7 and N9 subtypes of AIV，and no cross reaction with other subtypes of AIV and avian respiratory pathogens.The detection limit of the RT-LAMP assay was 10 copies using vitro transcription RNA of target genes.The newly developed RT-LAMP assay is specific，sensitive，simple，rapid and can identify H7，N9 and H7N9 subtype AIV visually，and it will be a very useful screening assay for prevention and control these diseases.

H7 subtype avian influenza viruses；N9 subtype avian influenza viruses；reverse transcription loop-mediated isothermal amplification；visual detection

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.014

2014-10-28

廣西特聘專家專項(xiàng) ( 2011B020)；廣西科技攻關(guān)重大專項(xiàng) (14121003-4-2；1222003-2-4)

羅思思(1985-)，女，廣西平南人，助理研究員，主要從事禽流感病原學(xué)和防控技術(shù)的研究

*通信作者：謝芝勛，研究員，E-mail: xiezhixun@126.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)07-1176-08