周晨慧，徐道華，汪肖云，陳文君，李 珊

（廣東醫(yī)學院護理學院，廣東東莞523808）

華支睪吸蟲硫氧還蛋白跨膜蛋白基因的生物信息學分析

周晨慧，徐道華，汪肖云，陳文君，李 珊

（廣東醫(yī)學院護理學院，廣東東莞523808）

目的對華支睪吸蟲硫氧還蛋白跨膜蛋白（Cs TMX）基因進行生物信息學分析。方法利用生物信息學方法（InterProScan、SignalP、TMHMM和SWISS-MODEL等相關軟件）對Cs TMX基因及相應氨基酸序列的同源性、理化性質、保守結構域、信號肽、親水性/疏水性、三級結構進行預測分析。結果Cs TMX基因的開放閱讀框（ORF）包含414 bp，編碼137個氨基酸，理論分子質量為16.04×103，等電點為5.16。TMHMM和SignalP3.0分析結果顯示Cs TMX含信號肽，其在第19~20位氨基酸之間有1個切割位點；InterProScan和SWISS-MODEL分析結果顯示，TMX特征性結構域位于第21~ 27位氨基酸之間，并且具有高度保守的CPAC基因序列。結論利用生物信息學知識和各種分析軟件對Cs TMX所編碼的cDNA序列及理論蛋白質的理化性質、結構和功能域等進行預測和分析，能夠為開展Cs TMX的表達及其功能研究提供理論依據(jù)。

華支睪吸蟲??； 硫氧還蛋白質類； 膜蛋白質類； 基因； 計算生物學

華支睪吸蟲病是由華支睪吸蟲感染引起的一種食源性人獸共患寄生蟲病，是當前我國最嚴重的食源性寄生蟲病之一。華支睪吸蟲囊蚴在十二指腸脫囊移入人或動物肝膽管中寄生，蟲體攝食和遷移產生的機械損傷及其分泌代謝產物引起的化學損傷，均可引起宿主一系列肝膽管組織的病理改變?；颊咴诩毙云诳杀憩F(xiàn)為膽囊炎、膽管炎、黃疸型肝炎等，慢性感染易導致膽結石、肝纖維化，晚期可發(fā)生肝硬化，甚至原發(fā)性膽管癌和肝癌[1-3]。在全球范圍內有近3 500萬人感染華支睪吸蟲，給人們的健康帶來巨大威脅[4-5]。因此，有必要通過對華支睪吸蟲基因組和功能基因組的研究，尋找合適的疫苗候選分子并深入研究其保護機制。

硫氧還蛋白跨膜蛋白（TMX）屬于硫氧還蛋白超家族的成員之一，具有還原酶的特性，且廣泛分布于多細胞生物。有研究報道，TMX可阻斷主要組織相容性復合體Ⅰ類重鏈，從而在炎癥或感染等病理狀態(tài)下發(fā)揮免疫保護作用[6-8]。本研究主要運用生物信息學方法對華支睪吸蟲TMX（Cs TMX）基因及相應氨基酸序列的同源性、理化性質、保守結構域、信號肽、跨膜結構域、親水性/疏水性、三級結構及活性位點進行預測分析，為研究Cs TMX的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 從華支睪吸蟲全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索CsTMX基因同源序列。

1.2 方法

1.2.1 Cs TMX基因的識別 將目的基因序列在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）和基因數(shù)據(jù)庫（GenBank）中的同源序列進行比對，判斷該基因是否是全長基因。從中選取編碼Cs TMX（GAA50073.1）的全長基因，應用NCBI網站open reading frame（ORF）finder確定其完整的編碼序列（coding sequence，CDS）。

1.2.2 生物信息學分析

1.2.2.1 通過ExPASy（http：//ca.expasy.org/）所提供的Prot Param、SignalP、InterProScan、TMHMM及SWISS-MODEL等在線工具預測蛋白質的理化性質、分泌信號肽、理論蛋白質一級結構中包含的結構和功能域特征序列、氨基酸序列跨膜區(qū)、理論蛋白功能位點，預測并模擬蛋白質的空間構象。

1.2.2.2 B細胞表位分析 利用B細胞表位在線分析軟件（http：//tools.immuneepitope.org/tools）預測蛋白質的B細胞表位。

2 結 果

2.1 CsTMX基因BlASTx的分析結果 BLASTx結果分析顯示，該基因cDNA全長456 bp，編碼區(qū)在1~414 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼137個氨基酸。Cs TMX屬于硫氧還蛋白超家族同源基因，與GenBank中的曼氏血吸蟲蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）的氨基酸序列的相似性為92%，一致性達51%，見圖1。

圖1 用NCBI的BLASTx程序進行Cs TMX同源性分析結果

2.2 蛋白質的理化性質 通過ProtParam程序（http：// web.expasy.org/protparam/）對Cs TMX進行理化性質預測，Cs TMX編碼序列一級結構分析顯示，該序列編碼137個氨基酸，理論相對分子質量為16.04×103，等電點為5.16，偏酸性。該蛋白序列的N末端為甲硫氨酸，其在哺乳動物網狀紅細胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母體內表達的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中表達的半衰期大于10 h。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為55.56，高于域值40。疏水指數(shù)為82.47，總親水性0.135，蛋白質總體疏水性較低。

2.3 信號肽序列分析 SignalP3.0分析結果顯示Cs TMX可能含信號肽，其切割位點在第19~20位氨基酸之間，見圖2。

2.4 InterProScan 掃描一級結構中包含的結構和功能域特征序列，分析結果顯示，Cs TMX屬于硫氧還蛋白超家族，硫氧還蛋白特征性結構域位于第21~27位氨基酸之間，見圖3。

2.5 TMHMM預測Cs TMX氨基酸序列的跨膜區(qū) 結果顯示，ans體疏水性較低，TMHMM預測氨基酸序列的跨膜區(qū)，Cs TMX有1個跨膜結構，位于第1~20位氨基酸之間，見圖4。

圖2 Cs TMX信號肽SignalP3.0分析結果

圖3 InterProScan分析Cs TMX一級結構中的功能域

圖4 TMHMM預測C s TMX氨基酸序列的跨膜區(qū)

2.6 B細胞線性表位分析 利用http：//tools.immuneepitope.org/tools的BepiPred分析工具預測Cs TMX的B細胞線性表位，分值較高的線性表位區(qū)域位于第27~32位氨基酸、第58~65位氨基酸、第74~77位氨基酸、第121~124位氨基酸之間（圖5），相應表位的氨基酸序列見表1。

圖5 C s TMXB細胞線性表位預測

2.7 SWISS-MODEL分析Cs TMX的三維結構 SWISSMODEL將Cs TMX與蛋白結構數(shù)據(jù)庫中的蛋白質三維結構進行匹配，得到模擬的華支睪吸蟲Cs TMX三維結構圖，左上角圓圈部分為其高度保守CPAC基因序列，見圖6。

表1 C s TMX組成B細胞表位氨基酸序列

圖6 SWI SS-MODEL分析華支睪吸蟲Cs TMX的三維結構

3 討 論

隨著分子寄生蟲學的不斷發(fā)展，從分子水平認識寄生蟲及其致病機制已成為寄生蟲研究領域的熱點之一。作者旨在研究Cs TMX及其編碼蛋白質的結構與功能，為解決華支睪吸蟲病的防治問題提供基礎理論性研究。

生物信息學是涵蓋生命科學、計算機科學及數(shù)學等學科，包含生物信息的獲取、處理、儲存、分發(fā)、分析和解釋的一門學科，目的在于了解大量的生物學意義[9]。本研究通過利用美國NCBI和歐洲ExPASy網站所提供的大量在線分析程序[10-11]，對華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫硫氧還蛋白超家族同源序列與NCBI網站進行多序列比對，從中選取編碼Cs TMX全長cDNA序列并對其編碼的氨基酸序列進行全面的生物信息學分析，包括其理化性質、功能域、跨膜結構、信號肽和三級結構等，為Cs TMX基因的后續(xù)研究提供線索和依據(jù)。

將Cs TMX與NCBI網站中的同源序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)Cs TMX編碼序列理論蛋白相對分子質量為16.04×103，等電點為5.16，偏酸性，重組蛋白在溶液中性質較不穩(wěn)定。TMHMM預測Cs TMX氨基酸序列的跨膜結構提示，Cs TMX含有1個跨膜區(qū)，跨膜結構位于第1~ 20位氨基酸之間。SignalP3.0分析結果顯示，Cs TMX含信號肽，其在第19~20位氨基酸之間有1個切割位點。TMHMM和SignalP3.0分析結果提示，在對Cs TMX進行原核系統(tǒng)表達時，應將Cs TMX氨基酸序列中編碼信號肽的部分取出，以有利于r Cs TMX在原核系統(tǒng)中的表達。目前已有研究證實，與Cs TMX同屬于硫氧還蛋白家族的PDI是日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝片吸蟲和牛血吸蟲等的分泌排泄抗原[12]。Blastx結果顯示Cs TMX與曼氏血吸蟲PDI高度同源，那么Cs TMX是否可以分泌到細胞外成為華支睪吸蟲的分泌排泄抗原（Cs ESAs）組成之一，還有待于進一步研究。Cs TMX的B細胞線性表位預測發(fā)現(xiàn)有4個分值較高的線性表位區(qū)域。

總之，利用生物信息學知識和各種分析軟件對Cs TMX所編碼的cDNA序列及理論蛋白質的理化性質、結構和功能域等進行預測和分析，有利于了解Cs TMX潛在的生物學功能，并為選擇和設計實驗方案提供一定的理論依據(jù)和策略。

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Bioinformaticsanalysisof thioredoxin transmembrane-related protein from clonorchis sinensis

Zhou Chenhui，Xu Daohua，Wang Xiaoyun，ChenWenjun，LiShan（SchoolofNursing，GuangdongMedicalCollege，Dongguan，Guangdong523808，China）

ObjectiveTo analyze protein characteristicsof thioredoxin-related transmembrane protein gene of clonorchis sinensis（Cs TMX）by bioinformation.MethodsThe homology，physicochemicalproperty，conserved domain，signal peptide，hydrophilcity，hydrophobicity and the tertiary structure of Cs TMX and amino acid sequencewere predicted by bioinformatic analysis software such as InterProScan，SignalP，TMHMM and SWISS-MODEL.ResultsThe open reading frame of Cs TMX cDNA included 414 bp，coded 137 amino acidswith theoreticalmolecularweightbeing16.04×103and isoelectric pointbeing 5.16.TMHMM and SignalP3.0 analysis showed that Cs TMX contained signal peptide，having a cleavage site between 19th and 20th aminoacids.InterproScan and SWISS-MODEL analysis indicated the characterized TMX domainwas found in the position of21st-27th amino acidsbeing possesswith highly conserved CPAC gene sequence.ConclusionThe bioinformatics analysis and various softwaremay predictand analyze cDNA sequences coded by Cs TMX and physicochemicalproperty，structure and function domain of theoreticalprotein，which isavailable forproviding theoreticalbasisofexpression of Cs TMX.

Clonorchiasis； Thioredoxin； Membrane protein； Gene； Computationalbiology

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.005

：A

：1009-5519（2015）07-0969-03

2014-10-13

2014-12-08）

廣東醫(yī)學院科研基金面上項目（M2011022）。

周晨慧（1974-），女，山西太原人，博士研究生，講師，主要從事病原生物學研究；E-mail：chenhuizh6@126.com。