蘭方宇，陳洪濤

（1.南寧市第八人民醫(yī)院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530022）

生物膜（biofilm，BF）是微生物（如細(xì)菌）被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一種特殊細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)［1］。生物膜將藥物與細(xì)菌隔離形成屏障，抗生素不能充分進(jìn)入到生物膜內(nèi)將細(xì)菌殺滅，據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的初步統(tǒng)計，80%的細(xì)菌性疾病與細(xì)菌生物膜有關(guān)［2］，菌膜?。ňひ鸬募膊。θ梭w的致病性主要表現(xiàn)在：一是菌膜釋放浮游菌造成慢性感染急性發(fā)作；二是生物膜中包裹細(xì)菌的多聚糖基質(zhì)會將細(xì)菌與機(jī)體免疫系統(tǒng)隔離開來，使特異性抗體、吞噬細(xì)胞等對細(xì)菌的攻擊難以奏效，影響機(jī)體免疫功能而致病。臨床上許多頑固性、難治性感染可能均與形成菌膜有關(guān)。目前應(yīng)用于臨床的抗菌藥并不能有效清除細(xì)菌生物膜，還可誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生［3］。我國有豐富的中藥資源，中藥在防止感染性疾病方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢，能產(chǎn)生多方面的藥理效應(yīng)，且價格低廉，毒副作用小，在抗細(xì)菌生物膜方面有廣闊的研究前景。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒等作用，是中醫(yī)臨床常用品種之一，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量研究。黃芩主要含黃酮類化合物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等40多種成分，其中黃芩苷、黃芩素等是其主要有效成分［4］，已有多項(xiàng)研究表明，黃芩有效成分對多種細(xì)菌有抑制作用，對細(xì)菌生物膜亦有一定的影響。本文就近年來黃芪及其有效成分對細(xì)菌生物膜抑制作用的研究情況綜述如下。

1 對銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginose，Pa）生物膜的影響

銅綠假單胞菌是臨床上獲得性感染的重要條件致病菌，尤其是粘液型銅綠假單胞菌容易形成生物膜，生成生物膜后具備較高的耐藥能力。謝林利等［5］研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、黃芩素體外能抑制Pa對固體表面的粘附能力，顯著抑制Pa生物膜的形成，還能破壞Pa已形成的早期和成熟期生物膜，對生物膜的破壞效果與阿奇霉素相似，且對Pa早期生物膜形成的抑制作用比對成熟生物膜的抑制作用強(qiáng)。王貴年等［6］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15.65 mg/L的黃芩苷對銅綠假單胞菌的生物膜的發(fā)育有明顯的破壞作用，通過減少細(xì)菌對載體的粘附，抑制和清除PaBF，同時抑制新的BF生成，增加抗菌藥物對BF的滲透性，是黃芩苷對細(xì)菌生物膜的主要作用機(jī)制。

黃芩與抗菌藥聯(lián)用還能產(chǎn)生協(xié)同作用?？讜x亮等［7］進(jìn)行了黃芩水煎液對Pa生物膜清除作用的研究，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用黃芩水煎液對早期或成熟BF內(nèi)的銅綠假單胞菌均沒有抗菌活性，但與頭孢他啶（CAZ）聯(lián)用后，黃芩水煎液對早期或成熟BF都有較強(qiáng)的破壞作用，增強(qiáng)了CAZ對BF內(nèi)細(xì)菌的清除作用，效果明顯優(yōu)于CAZ單獨(dú)使用，具協(xié)同殺菌作用。菅凌燕等［8］進(jìn)行了黃芩苷聯(lián)合左氧氟沙星對Pa生物膜影響的實(shí)驗(yàn)研究，該研究主要針對粘液型銅綠假單胞菌，其可合成粘液狀的胞外多糖藻酸鹽，致病力強(qiáng)于非粘液型。結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用黃芩苷，可使PaBF藻酸鹽含量減少，但差異不顯著（P＞0.05），黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用左氧氟沙星時，藻酸鹽含量降低約78.5%，產(chǎn)生顯著的協(xié)同抗菌效應(yīng)，因此該項(xiàng)研究推測，黃芩苷可能通過加強(qiáng)左氧氟沙星對銅綠假單胞菌生物膜的降解，協(xié)同發(fā)揮抗菌作用。

以上幾組試驗(yàn)研究均表明，黃芩有效成分對Pa沒有明顯的殺菌作用，但對Pa生物膜的形成有抑制作用，且抑制效果與14、15元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類相當(dāng)，聯(lián)用適當(dāng)?shù)目咕幒?，能協(xié)同發(fā)揮強(qiáng)大的抗菌作用。

2 對金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureu，S.a）生物膜的影響

金黃色葡萄球菌是引起臨床上化膿性感染的常見革蘭氏陽性致病菌，抗菌藥的廣泛應(yīng)用，致使多重耐藥的S.a及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢出率不斷增高，細(xì)菌BF的形成，對細(xì)菌起著強(qiáng)有力的保護(hù)作用，是引起細(xì)菌耐藥的一個主要因素。杜仲業(yè)等［9］進(jìn)行了黃芩素對金黃色葡萄球菌生物膜抑制作用的體外研究，結(jié)果顯示，黃芩素對MRSA和S.a的最小抑菌濃度（MIC）均為256 μg/ml，當(dāng)黃芩素濃度≥32 μg/ml時，能抑制金黃色葡萄球菌3 d和7 d生物膜形成，但不存在濃度依賴性關(guān)系，低于該濃度的黃芩素不能抑制BF的形成。

黃瑩瑩等［10］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素單獨(dú)作用于金黃色葡萄球菌生物膜時，與空白組相比活菌計數(shù)無明顯差異，但當(dāng)其與左氧氟沙星聯(lián)合作用后，活菌計數(shù)較空白組及左氧氟沙星組明顯減少（P＜0.05），推測黃芩素具有增強(qiáng)左氧氟沙星對生物膜滲透及殺菌作用。蒙錦祥等［11］觀察到，低于MIC的黃芩苷能破壞S.a已形成的BF，但不能殺滅細(xì)菌，與頭孢唑啉合用后，BF內(nèi)活菌計數(shù)較空白對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明合用后，能加速破壞BF的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)頭孢唑啉的滲透及對細(xì)菌的清除作用，顯示出協(xié)同殺菌作用。

陳強(qiáng)［12］觀察了黃芩液對MRSA生物膜的作用，電鏡掃描結(jié)果顯示，當(dāng)黃芩液濃度為2 048 μg/ml時，培養(yǎng)液中MRSA生物膜及活菌數(shù)明顯減少，說明黃芩液對MRSA及其生物膜有抑制作用。

3 對念珠菌生物膜的影響

念珠菌是真菌的一種，條件致病性真菌以白色念珠菌常見，但近年來白色念珠菌的分離率有所下降，對氟康唑敏感性較低的非白色念珠菌分離率有所增高，尤其是光滑念珠菌對氟康唑的耐藥率呈上升趨勢［13］。念珠菌生物膜的形成可使其有效抵御抗真菌藥物，而粘附是真菌在物體表面形成生物膜的第一步［14］。

汪長中等［15］的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 000、200 μg/ml的黃芩苷對白念珠菌的早期粘附有明顯抑制功能，即一定濃度的黃芩苷能通過影響白念珠菌的菌絲形成而抑制其生物膜的形成及其致病性。同時還發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在2 000 μg/ml時只引起40%的溶血，而常用的抗真菌藥兩性霉素B在125 μg/ml時便發(fā)生了溶血，二者相比，黃芩苷具有較弱的細(xì)胞毒性，黃芩苷等有效成分對治療白念珠菌生物膜感染疾病具有潛在臨床價值。黃杉［16］在黃芩素體外抗真菌研究實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，4～32 μg/ml的黃芩素對白色念珠菌生物被膜的抑制率達(dá)70%，明顯抑制念珠菌生物被膜的形成，其作用機(jī)制主要是黃芩素使作為白念珠菌重要毒力因子且在生物被膜形成中起重要作用的細(xì)胞表面疏水性值降低，此為黃芩素抑制白念珠菌生物被膜形成的分子機(jī)制之一。

汪長中等［17］還進(jìn)行了黃芩苷對非白念珠菌生物膜抑制作用的研究，在非白念珠菌的早期粘附階段，1 000 mg/L的黃芩苷對光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌等4種菌的粘附均有明顯抑制功能，而初始的粘附是生物膜形成的先決條件，提示了黃芩苷對多種真菌生物膜的早期發(fā)育具有明顯干預(yù)效應(yīng)。

4 對大腸桿菌（escherichia coli）生物膜的影響

王坤［18］通過實(shí)驗(yàn)摸索，建立可靠的大腸桿菌細(xì)菌生物膜（BBF）模型，考察了注射用雙黃連方中三味藥材——金銀花、連翹、黃芩不同提取部位對BBF形成的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩的醇提部分對大腸桿菌的BBF的形成和抑制作用較強(qiáng)，而醇提部分的氯仿和正丁醇的萃取部分對大腸桿菌BBF的形成和抑制作用較明顯，表明對BBF抑制作用明顯的為其脂溶性較強(qiáng)的部分。?？∪穑?9］進(jìn)行了自制中藥提取物、黃芩提取物單一用藥以及二者分別與頭孢他啶聯(lián)合用藥前后大腸桿菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)比較的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果單一用藥組、聯(lián)合用藥組與用藥前相比，生物膜被破壞，細(xì)菌數(shù)量減少，用藥前后活菌計數(shù)統(tǒng)計有顯著性差異，聯(lián)合用藥組與單一用藥組相比，活菌計數(shù)也明顯減少，組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義，證明了黃芩提取物可以破壞大腸桿菌生物膜，與頭孢他啶聯(lián)合用藥后，可以增強(qiáng)殺菌效果，并且降低各自的用藥劑量。

5 對其他細(xì)菌生物膜的影響

牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是非酵解糖的革蘭氏陰性厭氧球桿菌，是慢性牙周炎最主要的致病菌之一。張廣平［20］進(jìn)行了黃芩苷對Pg生物膜的抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果32.25 mg/L的黃芩苷對Pg生物膜有明顯的抑制和破壞，且作用與劑量成正比。黃芩苷對Pg生物膜的抑制作用可能是其抑制細(xì)菌粘附性的機(jī)制之一。

糞腸球菌主要以生物膜形式定植于根管中，是導(dǎo)致根管治療失敗的主要原因之一，付爽等［21］實(shí)驗(yàn)觀察到，黃芩苷對糞腸球菌的最小抑菌濃度為2 mg/ml，最小殺菌濃度為4 mg/ml，濃度為8 mg/ml時對糞腸球菌生物膜有明顯抑制作用。

溫紹霞等［22］進(jìn)行了黃芩素對肺炎克雷伯菌生長及生物膜形成能力影響的研究，結(jié)果顯示，加入濃度為30 μg/ml黃芩素的試管，細(xì)菌形成生物膜的厚度明顯較對照組薄，說明黃芩素能減弱肺炎克雷伯菌生物膜形成的能力。

另外官妍等［23］研究報道，黃芩苷對表皮葡萄球菌生物膜的粘附和代謝均無影響，說明黃芩苷不能抑制表皮葡球菌生物膜的形成。

6 展 望

廣譜抗菌藥的使用，導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn)，生物膜的生存方式增強(qiáng)了細(xì)菌對其不利因素的抵抗能力，使之能在惡劣環(huán)境中生存［24］。新抗生素的研究跟不上耐藥菌株的形成速度，而中藥在防治細(xì)菌生物膜引起的感染方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢。中藥黃芩的有效成分黃酮類化合物具有多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的藥理活性作用，且未見明顯的毒副作用，值得進(jìn)一步的研究開發(fā)［25］，而上述的種種研究也表明，黃芩及其有效成分既可抑制細(xì)菌生物膜的形成，又可與抗菌藥聯(lián)用增強(qiáng)抗感染能力，具有很高的研究價值。

通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前黃芩有效成分對多種細(xì)菌生物膜抑制的研究實(shí)驗(yàn)，基本上是停留在體外研究階段，體外與體內(nèi)的抗菌效果是否一致有待進(jìn)一步研究，同時還可以加強(qiáng)黃芩與其他中藥組成復(fù)方制劑，或者與抗菌藥聯(lián)用，通過藥物間的相互作用達(dá)到增強(qiáng)效果這方面的研究，明確抑制生物膜的活性單體及其作用靶點(diǎn)。期望通過對黃芩抗菌作用的系列研究，建立一種模式，延伸到其他中藥對細(xì)菌生物膜的抑制作用研究，從而更好地促使中藥在這方面領(lǐng)域的開發(fā)，與分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科共同發(fā)展，應(yīng)對日趨嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥問題的挑戰(zhàn)。

［1］唐婳，劉國生，謝志雄，等.細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2006，28（3）：30.

［2］李睿明.抗感染治療新靶點(diǎn)——細(xì)菌生物膜［J］.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2006，27（4）：42.

［3］陳鐵柱，李曉聲，曾文魁，等.細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的研究與進(jìn)展［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（12）：2205.

［4］徐玉田.黃芩的化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理作用研究進(jìn)展［J］.光明中醫(yī)，2010，25（3）：544.

［5］謝林利，周密，陳勇川，等.黃芩苷、黃芩素抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的研究［J］. 中國藥房，2010，21（39）：3651-3653.

［6］王貴年，范瑩，王龍梓，等.黃芩苷對銅綠假單胞菌生物膜的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（1）：131-132.

［7］孔晉亮，陳一強(qiáng)，閆萍，等.黃芩水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜清除作用的體外研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（5）：347-348.

［8］菅凌燕，何曉靜，于瑩.黃芩苷聯(lián)合左氧氟沙星對銅綠假單胞菌生物膜的影響及相關(guān)機(jī)制［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（14）：1097-1099.

［9］杜仲業(yè)，陳一強(qiáng)，孔晉亮，等.黃芩素對金黃色葡萄球菌生物膜抑制作用的體外研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（12）：19-22.

［10］黃瑩瑩，陳一強(qiáng)，孔晉亮，等.黃芩素聯(lián)合左氧氟沙星對金黃色葡萄球菌生物膜的體外作用［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（10）：2264-2266.

［11］蒙錦祥，陳一強(qiáng)，孔晉亮，等.黃芩苷協(xié)同頭孢唑啉對金黃色葡萄球菌生物膜的體外研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2012，14（12）：1-3.

［12］陳強(qiáng).三黃燒傷靈對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜影響的實(shí)驗(yàn)研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2014.

［13］沈銀忠.光滑念珠菌臨床分離株對氟康唑耐藥的機(jī)制研究［D］.上海：復(fù)旦大學(xué)，2008.

［14］史文娜，孫淑娟.白念珠菌生物膜的研究［J］.生命的化學(xué)，2008，28（5）：658.

［15］汪長中，程惠娟，徐穎，等.黃芩苷體外抗白念珠菌生物膜作用的研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（8）：78-80.

［16］黃杉.黃芩素抗白念珠菌的作用機(jī)制研究［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

［17］汪長中，程惠娟，張雄飛，等.黃芩苷對非白念珠菌生物膜抑制作用的研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（5）：641.

［18］王坤.細(xì)菌生物膜的形成和研究注射用雙黃連對細(xì)菌生物膜的影響［D］.長春：長春中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

［19］?？∪?自制中藥破壞大腸桿菌生物膜提高頭孢他啶作用的實(shí)驗(yàn)研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2014.

［20］張廣平.黃芩苷對牙齦卟啉單胞菌生物膜的抑菌實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5（14）：87-88.

［21］付爽，許穎，寧尚波，等.黃芩苷體外抑制糞腸球菌生物膜能力的研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26（1）：35-36.

［22］溫紹霞，武軍駐.黃芩素對肺炎克雷伯菌生長及生物膜形成能力影響的研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（20）：2707.

［23］官妍，謝萌，汪長中，等.連翹苷和黃芩苷對表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（10）：886-893.

［24］宋志軍，吳紅，Michael Givskov，等.細(xì)菌生物膜與抗生素耐藥［J］.自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13（10）：1017.

［25］高燕，顧振綸，蔣小崗，等.黃芩素藥理學(xué)研究新進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1767.