柳朝華，高士友，鄧朝暉，李 昀

（湖南省婦幼保健院生殖中心，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

慢速程序化冷凍人類擴(kuò)張期囊胚的效果觀察

柳朝華，高士友，鄧朝暉，李 昀

（湖南省婦幼保健院生殖中心，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

目的 探討慢速程序化冷凍在人類擴(kuò)張期囊胚冷凍中的應(yīng)用效果。方法收集2014年1～4月在本中心進(jìn)行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)治療的579個(gè)周期患者移植及冷凍后剩余的低質(zhì)量胚胎(包括異常受精胚胎)發(fā)育成的擴(kuò)張期囊胚87枚，用顯微注射針刺穿囊胚腔使之皺縮，然后行程序化冷凍(囊胚組)。對(duì)照組為同期行程序化凍融的卵裂期胚胎。比較兩組經(jīng)冷凍復(fù)蘇后的胚胎存活率。結(jié)果擴(kuò)張期囊胚復(fù)蘇率為80.46%，卵裂期胚胎復(fù)蘇率為82.80%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.105，P＞0.05)。結(jié)論擴(kuò)張期囊胚經(jīng)人工皺縮后行程序化冷凍行之有效，能明顯提高囊胚的冷凍效率。

擴(kuò)張期囊胚；人工皺縮；慢速程序化冷凍

隨著囊胚移植的發(fā)展，囊胚的冷凍保存顯得日益重要，改進(jìn)和完善囊胚的冷凍保存方法成為當(dāng)前輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。普通的程序化冷凍人類囊胚雖已獲得妊娠及足月分娩，但易出現(xiàn)冷凍損傷，使得復(fù)蘇率和妊娠率不穩(wěn)定[1]。較多研究表明人工皺縮囊胚腔能有效提高囊胚玻璃化冷凍的效果[2-3]。而隨著玻璃化冷凍技術(shù)的飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外一部分生殖中心已經(jīng)放棄了慢速程序化冷凍。人類胚胎冷凍真的已經(jīng)到了玻璃化冷凍的時(shí)代了嗎？

本研究應(yīng)用慢速程序化冷凍法凍融人工皺縮后擴(kuò)張期囊胚及卵裂期胚胎，分別比較兩組胚胎復(fù)蘇后的存活情況，觀察慢速冷凍對(duì)擴(kuò)張期囊胚的凍存效果，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1～4月在本生殖中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)治療的579個(gè)周期資料?；颊吣挲g22～43歲，平均(31.9±4.2)歲。不孕原因包括輸卵管因素、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、男方因素及不明原因不孕等。夫妻雙方染色體結(jié)果均正常。

1.2 方法 采用本中心常規(guī)方法促排卵、取卵，體外受精及培養(yǎng)，根據(jù)患者及胚胎情況決定移植時(shí)間，剩余的符合冷凍標(biāo)準(zhǔn)的胚胎進(jìn)行程序化冷凍。對(duì)于移植或冷凍后剩余的非優(yōu)質(zhì)胚胎(胚胎碎片較多或者發(fā)育速度緩慢)及異常受精胚胎，經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。如果有囊胚形成，將符合冷凍標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)張期囊胚人工皺縮后進(jìn)行冷凍保存。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 人工皺縮后囊胚組和同期行胚胎凍融的卵裂期胚胎組。

1.2.2 囊胚的人工皺縮 采用注射針抽穿法行人工皺縮，即用TPC持卵針固定擴(kuò)張期囊胚，使內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位置位于6點(diǎn)附近，Humagen注射針從2點(diǎn)附近進(jìn)入，進(jìn)入點(diǎn)在兩個(gè)滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞的連接處，穿透囊腔后抽出，囊胚自然皺縮。

1.2.3 胚胎冷凍與復(fù)蘇 人工皺縮后囊胚冷凍保存方法與卵裂期胚胎相同，采用常規(guī)的慢速程序化冷凍法，冷凍保護(hù)劑為1.5 M丙二醇和0.1 M蔗糖，程序降溫儀使用FREEZE CONTROL(CL-8800i，澳大利亞)。復(fù)蘇法采用快速法。對(duì)于卵裂期胚胎，復(fù)蘇后至少有半數(shù)以上卵裂球完整視為存活。對(duì)于囊胚，復(fù)蘇后培養(yǎng)2～4 h，囊胚重新擴(kuò)張到具有正常內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層形態(tài)視為存活。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較兩組復(fù)蘇率，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

囊胚組解凍囊胚87枚，存活70枚，復(fù)蘇存活率為80.46%(70/87)，卵裂期胚胎組解凍胚胎186枚，存活154枚，復(fù)蘇存活率為82.80%(154/186)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.105，P＞0.05)。

3 討論

慢速程序化冷凍是一種平衡冷凍法，通過交換細(xì)胞內(nèi)外液體從而減少在冷凍過程中因滲透平衡出現(xiàn)問題對(duì)細(xì)胞造成的損傷。程序化冷凍中使用的冷凍保護(hù)劑濃度相對(duì)較低，不會(huì)對(duì)胚胎造成嚴(yán)重的毒性及滲透損傷，因此被認(rèn)為是一種安全的冷凍方法。近年來發(fā)展迅速的玻璃化冷凍法是一種非平衡冷凍法，與程序化冷凍法相比具有便捷、冷凍效果好等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)在于使用的高濃度冷凍保護(hù)劑增加了對(duì)胚胎的毒性作用，并且有潛在的生物污染可能。有文獻(xiàn)報(bào)道，慢速程序化冷凍法經(jīng)改良后對(duì)于卵裂期胚胎凍存可達(dá)到與玻璃化冷凍相當(dāng)?shù)男Ч鸞4-5]。多年來本中心一直用慢速程序化法冷凍胚胎，對(duì)于卵裂期胚胎也一直有著較高的復(fù)蘇存活率及移植妊娠率。隨著囊胚培養(yǎng)和囊胚移植的快速發(fā)展，囊胚的冷凍保存成為輔助生殖領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。理論上囊胚腔擴(kuò)張程度越大其種植潛能越高，然而擴(kuò)張期囊胚冷凍后復(fù)蘇效果卻不及早期囊胚，囊胚腔的擴(kuò)張程度明顯影響其冷凍效果[6]。囊胚的顯著特點(diǎn)就是其囊腔內(nèi)充滿液體，在與冷凍保護(hù)劑作用過程中，囊胚脫水皺縮速度較卵裂期胚胎要慢，囊胚腔越大，囊胚液就越多，就越可能減弱冷凍保護(hù)劑的作用而導(dǎo)致脫水不充分，在降溫及復(fù)溫過程中囊胚細(xì)胞內(nèi)就更有可能形成冰晶從而影響冷凍效果[7]。為此，有學(xué)者依據(jù)囊胚的特點(diǎn)，提出人工皺縮的解決辦法，通過減少囊腔的液體量以避免因脫水不充分形成冰晶而造成的機(jī)械損傷。即在玻璃化冷凍前，用玻璃微細(xì)管反復(fù)吹打、顯微針刺入囊胚腔抽吸及激光打孔、顯微針在滋養(yǎng)層上打孔等人工皺縮的方法來減少囊胚腔容積[8-10]。這些研究結(jié)果均表明，人工皺縮能明顯提高囊胚的玻璃化冷凍效率，提高復(fù)蘇后囊胚在體外及體內(nèi)的繼續(xù)發(fā)育能力。本研究中，經(jīng)顯微注射針刺穿囊胚腔使其自然皺縮后，用慢速程序化冷凍方法保存，快速法解凍，囊胚復(fù)蘇率同樣可以達(dá)到與卵裂期胚胎相當(dāng)水平。因此，囊胚在經(jīng)過顯微注射針人工皺縮預(yù)處理后再進(jìn)行慢速程序化冷凍行之有效，可應(yīng)用于臨床。

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R714.13

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1003—6350（2015）07—1048—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0375

2014-09-18)

柳朝華。E-mail：liuxu8007@163.com