劉麗麗，劉 謙，鹿 寧，劉曉慧

（保定出入境檢驗檢疫局，河北 保定 071051）

黃粉蟲俗稱“面包蟲”，其幼蟲富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和多種微量元素，素有“動物蛋白飼料之王”的稱譽(yù)。在傳統(tǒng)應(yīng)用中，黃粉蟲作為寵物飼料主要是用于特種養(yǎng)殖，將鮮活或干蟲用于飼養(yǎng)蝎子、金錢龜、觀賞魚類、鳥類、蛙類、蛇類等一些經(jīng)濟(jì)價值較高的特種經(jīng)濟(jì)動物，能加快生長發(fā)育，提高抗病免疫能力，降低飼料成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[1]。近年來，黃粉蟲逐漸作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，在加快動物生長速度，擴(kuò)大繁殖量，增強(qiáng)抗病力，提高存活率等方面作用顯著。另外有研究表明，黃粉蟲蟲蛻中提取的甲殼素的質(zhì)量優(yōu)于蝦蟹殼中甲殼素的質(zhì)量，因為其碳酸鹽含量低、色素少[2]，其出口量也在逐年增加，市場前景廣闊。在河北省保定地區(qū)一次出口黃粉蟲飼料風(fēng)險監(jiān)控中，發(fā)現(xiàn)其氨基脲含量超標(biāo)。

氨基脲是一種聯(lián)胺類小分子化合物，通常被認(rèn)為是禁用藥物呋喃西林的代謝產(chǎn)物。動物源性食品中氨基脲的殘留通常是由于在動物養(yǎng)殖過程中使用了呋喃西林后代謝產(chǎn)生的[3]。目前，很多國家都以檢測呋喃西林代謝產(chǎn)物-氨基脲判斷是否在養(yǎng)殖過程中非法使用了呋喃西林，以達(dá)到對呋喃西林原藥監(jiān)控的目的。歐盟、日本及中國[4]先后規(guī)定呋喃西林及代謝物在動物源性食品中不得檢出。然而，2014 年在一次出口黃粉蟲飼料風(fēng)險監(jiān)控中，發(fā)現(xiàn)其氨基脲含量超標(biāo)。尤其是黃粉蟲干品，陽性率高達(dá)100%。有研究表明，呋喃西林并非是氨基脲的惟一來源。非動物源性食品中的氨基脲主要來源有發(fā)泡劑偶氮酰胺和食品添加劑卡拉膠的使用，而甲殼類水產(chǎn)品中的氨基脲則作為內(nèi)源性物質(zhì)存在于甲殼類水產(chǎn)動物體中[5-6]。為了調(diào)查黃粉蟲氨基脲超標(biāo)的原因，本試驗通過對黃粉蟲飼料，黃粉蟲幼蟲，蟲蛹，成蟲以及蟲蛻和肉中氨基脲含量的研究，證實了氨基脲自然存在于黃粉蟲體內(nèi)；屬內(nèi)源性物質(zhì)，此研究結(jié)果從根本上解釋了黃粉蟲中氨基脲超標(biāo)的原因，為黃粉蟲中氨基脲的殘留研究提供了技術(shù)支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑 Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ESI 源）；梅特勒天平；PHS-3C雷磁精密pH 計；3-30K 高速離心機(jī)（SIGMA公司）；SHA-B恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司），EYELA氮吹儀，EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氨基脲鹽酸鹽和氨基脲同位素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；甲醇、乙酸乙酯、正己烷（色譜純，天津科密歐公司）；二甲基亞砜、2-硝基苯甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀（分析純，天津科密歐公司）；樣品定溶液：10 mL 乙腈0.1 mL 甲酸用水定容100 mL；衍生劑：0.0375 g 2-硝基苯甲醛用5 mL 二甲亞砜溶解。

1.2 樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取樣品1.0 g（蛻皮取0.5 g）（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入50 μL（1 μg/mL）內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混合30 s，加入10 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液和150 μL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋30 s 后，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加5 mL 1.0 mol/L 磷酸氫二鉀溶液混勻后，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.2 左右；加入15 mL 乙酸乙酯，渦旋60 s，以10 000 r/min 離心5 min，取上層清液至100 mL 雞心瓶中，加入10 mL 乙酸乙酯重復(fù)提起1次，合并提取液，于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 樣品定溶液和2 mL 正已烷，渦旋混合1 min；倒入5 mL 玻璃離心管中，以2 000 r/min離心5min，取下層溶液過0.22 μm 濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取干凈50 mL 離心管添加氨基脲濃度分別為20、50、100、200、500、1 000 μg/kg 內(nèi)標(biāo)50 μL，衍生劑150 μL 處理步驟同1.2。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜分析條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：CNWC18，100A，5 μm，150 mm×2.1 mm(內(nèi)徑)；流動相：洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣：50 L/h；霧化氣：800 L/h；離子源溫度：120 ℃；定性離子對，定量離子對，去簇電壓和碰撞能量見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件 按照GB/T 20752-2006 對黃粉蟲各日齡段干品進(jìn)行處理時，由于黃粉蟲干品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，成粉末狀，在進(jìn)行固相萃取極容易堵塞固相萃取柱，過柱及抽干時間較長。本方法通過乙酸乙酯液液萃取，高速離心，有效避免了堵塞萃取柱的問題，同時縮短了前處理時間，提高了工作效率。

2.2 方法線性范圍 按1.3 節(jié)的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定后，以濃度為橫坐標(biāo)，氨基脲峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。試驗表明，氨基脲濃度在20～1 000 ng/mL 范圍內(nèi)與其峰面積比值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.1884x+0.1534，r=0.9998。

2.3 檢出限 通過空白基質(zhì)添加0.5 μg/kg 氨基脲經(jīng)1.2 處理后進(jìn)行檢測，回收率和精密度符合GB/T27404-2008 的要求，故檢出限為0.5 μg/kg。

2.4 黃粉蟲飼料及各階段干品中氨基脲的含量見表3，各日齡段黃粉蟲及蟲蛻和肉中氨基脲定量離子流圖見圖1。

圖1 各日齡段黃粉蟲和蟲蛻以及肉中氨基脲定量離子流圖

由表3 可以看出，黃粉蟲肉中氨基脲含量甚微，飼料中完全不含氨基脲，但隨著黃粉蟲日齡的增長，氨基脲的含量呈明顯的上升趨勢，特別是從幼蟲變成蟲蛹，氨基脲的含量大幅增加，蟲蛻中氨基脲的含量比幼蟲中氨基脲的含量高很多。

表3 黃粉蟲飼料及各階段干品氨基脲含量

3 結(jié)論

通過對黃粉蟲飼料，各日齡段幼蟲干品、蛹、成蟲、蛻皮以及黃粉蟲肉進(jìn)行氨基脲的檢測，確定黃粉蟲飼料中不含氨基脲，黃粉蟲各日齡段氨基脲含量都很高，而蛻皮氨基脲含量比幼蟲含量高很多，這可能跟黃粉蟲生長后期，身體外殼逐漸變硬，甲殼素含量增加（與河蝦，雄蜂蛹相類似）有關(guān)。因此將黃粉蟲中氨基脲定性為內(nèi)源性物質(zhì)，為黃粉蟲中氨基脲的殘留分析提供了技術(shù)支撐。

[1]王丙麗，王洪亮，趙志強(qiáng)，等.黃粉蟲蟲蛻中甲殼素的提取條件研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，1：118-119.

[2]Leitner A，Zollner P，Lindner WJ，et al.Determination of the metabolites of nitrofuran antibioties in animal tissue by high-perfonmance liquid chromatog rayhy tandem mass spectometry[J].chromatog A，2001，939（1-2）：49-58.

[3]Bulletin of Ministery of Agriculture of the People's Republic of China 235 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235 號.

[4]Robert MC，Bob H，David E，et al.Food Chemistry，Available online 25 November 2011.

[5]Christof VP，Christ D，Mathieu W，Jan K，Patrick S，Carlos VP.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：2107-2112.

[6]周萍，胡福良，章征天，等.雄蜂蛹中硝基呋喃類代謝物含量的測定及超標(biāo)原因分析[J].中國蜂業(yè)，2008，59（7）：5-9.

[7]張睿，張曉燕，吳斌，等.甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲的測定和來源分析[J].環(huán)境化學(xué)，2012，31（6）：195-196.

[8]倪永付，朱莉萍，王勇，等.微山湖小青蝦各部分呋喃西林代謝物含量測定[J].食品與發(fā)酵科技，2012，48（1）：86-88.

[9]趙東豪，黎智廣，李劉冬，等.蝦苗使用呋喃西林和呋喃唑酮的殘留評估[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2012，8（7）：54-58.

[10]趙艷，張鳳枰，劉耀敏.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定凡納濱對蝦中的硝基呋喃代謝物殘留[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2011，7（4）：55-60.

[11]丁磊，蔣俊樹，顧亮.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物研究[J].食品科學(xué)，2010，11：336-345.

[12]于慧娟，李冰，蔡友瓊，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定甲殼類水產(chǎn)品中氨基脲的含量[J].分析化學(xué)，2012，40（10）：1530-1535.