劉 磊 李首慶 米旭光 方艷秋 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長春 130021)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，約55%發(fā)生在中國［1］，肝細(xì)胞癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)常到中、晚期，手術(shù)切除5 年復(fù)發(fā)率高達(dá)65%以上［2］。因此，尋找有效的預(yù)測指標(biāo)和有效治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。microRNA-199a/b-3p 被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中低表達(dá)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有抑癌活性［3-6］。在肝癌中其表達(dá)降低，但是其與肝細(xì)胞預(yù)后及病理特征的關(guān)系尚不清楚［3］。本研究旨在肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本的基礎(chǔ)上分析miR-199a/b-3p 與肝細(xì)胞癌預(yù)后及相關(guān)病例參數(shù)的關(guān)系，繼而探討miR-199a/b-3p 與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本研究共收集HCC 組織標(biāo)本107例，患者基本資料見表1。每例肝細(xì)胞癌患者至少經(jīng)過超聲、CT 和組織病理學(xué)中的兩種方法，并結(jié)合肝炎病史及AFP 水平而確診，診斷依據(jù)為《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011 年版)》［7］。標(biāo)本均取自2011年1 月至2014 年12 月之間手術(shù)的肝細(xì)胞癌患者(標(biāo)本來自吉林省人民醫(yī)院、吉林大學(xué)第一醫(yī)院、吉林大學(xué)第二醫(yī)院、吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)，肝細(xì)胞癌與對應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm 以上且病理證實(shí)無癌細(xì)胞殘留)新鮮組織于-80℃冰箱超低溫保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 AFP 抗體與免疫組化試劑盒(武漢博士德公司，中國)、microRNA-199a-3p 和U6 引物(上海生工，中國)、TRIzol?Reagent(Life Technologies，美 國)、FS Universal SYBR Green Master(Roche，美國)、GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，美國)、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國)。

1.3 組織總RNA 提取 所有-80℃冰箱超低溫保存組織樣本浸入液氮，取出后研磨，加入TRIzol 裂解，氯仿沉淀蛋白，離心取上清，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇溶液洗滌沉淀兩次，每個(gè)獲得的RNA 沉淀重懸于20 μl DEPC 水，所有的RNA 質(zhì)量通過分光光度計(jì)檢測并定量。

1.4 microRNA-199a/b-3p 檢測 每樣本取1 μg 總RNA，依據(jù)GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒方法進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)FS Universal SYBR Green Master 說明書，配置10 μl 反應(yīng)體系，U6 為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后分析qRT-PCR 反應(yīng)曲線，得到Ct 值，采用2-ΔΔCt法分析miR-199a/b-3p 表達(dá)量。miR-199a/b-3p 定量引物:F-GTCAC AGTAG TCTGC ACAT;R-GTGCA GGGTC CGAGGT。U6 定量引物:F-CTCGC TTCGG CAGCA CA;R-AACGC TTCAC GAATT TGCGT。所有樣本重復(fù)三次。

1.5 隨訪 電話及門診結(jié)合的方式隨訪，術(shù)后無瘤生存時(shí)間為自手術(shù)之日起至其影像學(xué)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)，或末次隨訪時(shí)間(2014 年12 月)所經(jīng)歷的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用成組設(shè)計(jì)的單因素方差分。P＜0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-199a/b-3p 在肝癌組織中表達(dá)高低以高于或低于中位數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織中miR-199a/b-3p表達(dá)水平差異 通過對107 例HCC 患者的癌組織及癌旁組織的miR-199a/b-3p 表達(dá)急性定量分析，我們發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-3p 在癌組織的中位相對表達(dá)量為0.537 ±0.378，顯著低于相應(yīng)癌旁組織的相對表達(dá)量2.113 ±0.505(P＜0.05)，見圖1。

2.2 miR-199a/b-3p 表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系 對107 例患者病理參數(shù)與其癌組織及癌旁組織中miR-199a/b-3p 表達(dá)比進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p 相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、乙肝感染、AFP表達(dá)、肝硬化及TNM 分期無關(guān)，但與轉(zhuǎn)移相關(guān)(表2)。

2.3 miR-199a/b-3p 表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系 以miR-199a/b-3p 相對表達(dá)量的中位數(shù)為界限，將107例患者分為miR-199a/b-3p 高表達(dá)組，共19 例;低表達(dá)組，共88 例。經(jīng)Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-3p 相對高表達(dá)的患者術(shù)后無瘤生存期顯著優(yōu)于miR-199a/b-3p 低表達(dá)患者(圖2)。

圖1 HCC 組織miR-199a/b-3p 相對表達(dá)水平Fig.1 Relative expression of miR-199a/b-3p in HCC

表2 HCC 組織中miR-199a/b-3p 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of miR-199a/b-3p and clinic pathological features of HCC

圖2 miR-199a/b-3p 高表達(dá)與低表達(dá)HCC 的無瘤生存期比較Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of HCC patients with higher or lower expression of miR-199a/b-3p

3 討論

人類基因組中存在著約1 000 個(gè)microRNA 基因，被證實(shí)的miRNA 已有500 多種，人類三分之一的基因受miRNA 的調(diào)控［8，9］。隨著對miRNA 的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA 作為一種新型的調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在人類基因組中，miRNA 多聚集在與腫瘤相關(guān)的一些基因多變區(qū)以及脆性位點(diǎn)，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10，11］。因此，miRNA 在腫瘤診斷、腫瘤分型、預(yù)后判斷及基因治療的作用會(huì)越來越受到關(guān)注，miRNA可能成生物靶向治療的新靶點(diǎn)，未來此類藥物會(huì)不斷出現(xiàn)，可能為腫瘤及其他疾病帶來治療的新希望。

有研究顯示，miR-199a-3p 在前列腺癌高、低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞中存在表達(dá)差異，高轉(zhuǎn)移潛能1E8 細(xì)胞中miR-199a-3p 表達(dá)水平明顯低于低轉(zhuǎn)移潛能2B4細(xì)胞，上調(diào)miR-199a-3p 會(huì)減弱1E8 細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力，說明上調(diào)miR-199a-3p 可以抑制前列腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力［4］。MiR-199a-3p 在腎癌細(xì)胞中明顯低表達(dá)，在78%(14/18)的腎癌組織中明顯低表達(dá);上調(diào)miR-199a-3p 可顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖、存活和侵襲并能誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1 期阻滯，這表明miR-199a-3p 具有作為腎癌診斷和治療靶點(diǎn)的潛能［5］。另有研究顯示miR-199a-3p 在骨肉瘤細(xì)胞中顯著低表達(dá)，而外源轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞后，可顯著抑制細(xì)胞生長侵襲，誘導(dǎo)了細(xì)胞周期G1 期阻滯，和mTOR 和Stat3 表達(dá)被抑制，說明miR-199a-3p 抑制的靶基因在骨肉瘤細(xì)胞存活發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，可作為骨肉瘤治療的靶點(diǎn)［6］。而在肝細(xì)胞癌(HCC)組織樣本分析中發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p 表達(dá)水平與正常肝組織相比顯著下調(diào)。在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中外源表達(dá)miR-199a-3p 可顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。通過病毒載體導(dǎo)入miR-199a-3p 后可減小肝細(xì)胞癌細(xì)胞異種移植物的體積，說明miR-199a-3p抑制的靶基因在HCC 的存活發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是HCC 新的治療靶點(diǎn)［3］。但miR-199a-3p 與肝細(xì)胞癌預(yù)后及相關(guān)病理特征的關(guān)系尚不清楚。

本研究通過檢測107 例肝細(xì)胞癌組織及對應(yīng)癌旁組織的miR-199a/b-3p 表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，在癌組織的中位相對表達(dá)量為0.537 ±0.378，顯著低于相應(yīng)癌旁組織的相對表達(dá)量2.113 ±0.505(P＜0.05)，說明miR-199a/b-3p 作為重要抑癌基因其表達(dá)被HCC 抑制。通過病理參數(shù)與其癌組織與癌旁組織中miR-199a/b-3p 表達(dá)比進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p 相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、乙肝感染、AFP 表達(dá)、肝硬化及TNM 分期無關(guān)，但與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，說明miR-199a/b-3p 抑癌機(jī)制可能與抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)。最后，我們以癌組織中miR-199a/b-3p 相對表達(dá)量的中位數(shù)為界限，將107 例患者分為miR-199a/b-3p 高表達(dá)組，共19 例;低表達(dá)組，共88 例。經(jīng)Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-3p 相對高表達(dá)的患者術(shù)后無瘤生存期顯著優(yōu)于miR-199a/b-3p 低表達(dá)患者，說明miR-199a/b-3p 低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。綜上所述，miR-199a/b-3p 在肝癌中作為抑癌基因存在，其低表達(dá)可提示預(yù)后不良;miR-199a/b-3p 對肝癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移起到重要抑制作用，可以作為有效的肝癌治療靶點(diǎn)。

［1］Bosch FX，Ribes J.Primary liver cancer:Worldwide incidence and trends［J］.Gastroenterology，2004，127(15).

［2］李 焱，程 明.中晚期肝癌臨床治療進(jìn)展［J］.臨床肝膽病雜志，2014，30(3):233-236.

［3］Hou J，Lin L，Zhou W，et al.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2011，19(2):232-243.

［4］孔繁飛，王中顯，孫朝陽，等.miR-199a-3p 對前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響［J］.腫瘤防治研究，2011，38(8):875-877.

［5］陶良俊，秦 超，曹 強(qiáng)，等.microRNA-199a-3p 在腎癌中的表達(dá)及作用［J］.現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志，2012，4(4):229-232.

［6］Zhenfeng Duan，Edwin Choy，David Harmon，et al.microRNA-199a-3p is downregulated in human osteosarcoma and regulates cell proliferation and migration［J］.Molecular Cancer Therapeutics，2011，10(8):1337-1345

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011 年版)［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27(11):1141-1160.

［8］Jiang L，Cheng Q，Zhang BH.Circulating microRNAs as biomarkers in hepatocellular carcinoma screening:a validation set from China［J］.Medicine (Baltimore)，2015，94(10):e603.

［9］Bockmeyer CL，Christgen M，Muller M，et al.MicroRNA profiles of healthy basal and luminal mammary epithelial cells are distinct and reflected in different breast cancer subtypes［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，130(3):735-745.

［10］Blenkiron C，Goldstein LD，Thorne NP.MicroRNA expression profiling of human breast cancer identifies new markers of tumor subtype［J］.Genome Biol，2007，8(10):R214.

［11］Acunzo M，Romano G，Wernicke D，et al.MicroRNA and cancer-a brief overview［J］.Adv Biol Regul，2015，57(3):1-9.