王曉倩 李 鑫 郭建生 朱克儉

(湖南中醫(yī)藥大學中藥現(xiàn)代化研究湖南省高校重點實驗室，長沙 410208)

痛風性關節(jié)炎(Gouty arthritis，GA)是一種由于體內嘌呤代謝異常，使尿酸鈉在關節(jié)腔內沉積形成結晶，造成關節(jié)腫脹、變形的結晶性關節(jié)炎［1］。隨著居民大量的攝食蛋白質及富含嘌呤成分的食物，痛風已成為影響我國人口健康的重大代謝性疾病之一，引起國內外醫(yī)學界的高度關切［2］。

研究認為，痛風發(fā)病機制主要為血液中尿酸含量升高，達到飽和狀態(tài)形成尿酸鈉微結晶。當關節(jié)腔內的尿酸鹽結晶被白細胞吞噬后，沉積并刺激關節(jié)滑膜、軟骨及關節(jié)周圍組織，釋放出組胺、趨化因子及相關前炎癥因子等物質，使調節(jié)炎癥反應的基質金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinases，MMP-1)高表達，導致MMP-1/TIMP-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-1，組織金屬蛋白酶抑制劑-1)失衡，關節(jié)軟骨發(fā)生病理性改變［3］，導致局部血管擴張、白細胞大量聚集，大量炎性細胞浸潤［4］，形成痛風性關節(jié)炎［5］。

目前臨床治療痛風以緩解癥狀為主，多使用秋水仙堿、吲哚美辛等非甾體類化學藥品。然而上述藥物的使用并不能延緩病情發(fā)展，且存在腹瀉、血小板減少等副作用。中醫(yī)學認為，痛風以脾、腎虧虛為本，痰瘀、濕熱為標，痰瘀為病之變，濕熱為病之現(xiàn)［6］。中醫(yī)藥治療痛風不僅療效確切，且安全性高。本課題組擬研發(fā)治療痛風性關節(jié)炎的創(chuàng)新中藥——金鳳顆粒，該藥由萆薢、鳳尾草、艾葉、金錢草等組成。前期研究顯示，金鳳顆粒能顯著降低氧嗪酸鉀鹽所致高尿酸血癥小鼠的尿酸水平［7］，能有效抑制TNF-α、IL-8、IFN-γ 等促炎性因子釋放［8］。本研究擬建立痛風性關節(jié)炎實驗兔模型，研究金鳳顆粒對關節(jié)病理損傷及關節(jié)軟骨MMP-1/TIMP-1 的影響，進而明確其治療痛風性關節(jié)炎的作用機制，為其臨床治療痛風性關節(jié)炎提供科學實證依據(jù)。

在開展本實驗研究工作前均簽署動物實驗倫理審查書，且所有工作的進行均符合動物實驗相關條件及動物實驗倫理審查委員會的相關要求及所有規(guī)定。

1 材料與方法

1.1 試藥及試劑

1.1.1 受試藥物 金鳳顆粒(No.140301)，湖南省中醫(yī)藥研究院;腺嘌呤(No.0183)，英國Amresco 公司;尿酸鈉(No.U2875)，美國Sigma 公司;鹽酸乙胺丁醇片(No.1304041)，沈陽紅旗制藥有限公司;別嘌醇片(No.20140108)，廣東彼迪藥業(yè)有限公司;痛風定膠囊(No.1405112)，四川升和藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 試劑 兔抗人MMP-1(No.BA0568)、TIMP-1(No.BA0575)多克隆抗體，SABC 免疫組化染色試劑盒(No.SA1022)，DAB 顯色試劑盒(No.AR10 22)，武漢博士德生物工程有限公司;甲醛溶液(No.20140204)，天津市百世化工有限公司。

1.1.3 實驗動物 新西蘭家兔，雄性，體重1.5～2 kg，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證編號:SCXK(湘)2011-0003。

1.2 方法

1.2.1 痛風性關節(jié)炎家兔模型建立［9］取新西蘭家兔70 只，按體重進行隨機化分組，分為空白組(10只)和模型組(60 只)。模型組灌服腺嘌呤(200 mg/kg)和乙胺丁醇(250 mg/kg)，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后30 min，將10%MSU 混懸液經(jīng)上髕骨韌帶(關節(jié)伸直45°，4 號針頭進針，插入脛骨肌腱內側)注射入兔右踝關節(jié)關節(jié)腔，0.3 ml/只，復制痛風性關節(jié)炎模型。

1.2.2 分組及給藥 模型成功后，按體重進行隨機化分組，分為模型組、金鳳顆粒高、中、低劑量組(19.6、9.8、4.9 g/kg)、別嘌醇組(0.028 g/kg)及痛風定組(0.448 g/kg)。各組分別給予相應藥液，模型組、空白組給予等容積蒸餾水，ig 給藥，8 ml/kg，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 金鳳顆粒對痛風性關節(jié)炎家兔關節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學改變的影響 末次給藥24 h 后，麻醉家兔，取關節(jié)軟骨組織，10 %甲醛溶液固定，將軟骨病理標本做成蠟塊，間斷連續(xù)切片，切片厚約5 μm，HE 染色，采用盲法實驗原則，選用未知分組人員觀察其病理形態(tài)學的改變，并評分，評分標準見表1［10］。

1.2.4 金鳳顆粒對痛風性關節(jié)炎家兔關節(jié)軟骨中MMP-1、TIMP-1 表達的影響 末次給藥2 h 后，麻醉家兔，取關節(jié)軟骨組織，于10%甲醛溶液固定，行免疫細胞化學檢測。嚴格按照試劑盒說明操作，采用免疫細胞化學SP(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物)法檢測。每張切片選取5 個典型區(qū)域拍攝數(shù)碼圖像，使用圖像分析軟件分析各組照片的單位光密度值并進行比較，根據(jù)光密度值的大小判斷各指標表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用±s 表示。組間比較，計量資料首先做正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足方差齊性，采用Oneway ANOVA 進行方差分析，不滿足方差齊性采用非參數(shù)法檢驗。P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01差異有高度統(tǒng)計學意義。

表1 關節(jié)軟骨組織學改變的組織學分級評分標準Tab.1 Histological classification criteria of synovial histologic change

2 結果

2.1 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織病理變化的影響 空白組關節(jié)軟骨面完整，未見有血管充血、黏膜腫脹、炎細胞浸潤及組織壞死，也未見有絨毛狀增生和血管翳形成。模型組家兔關節(jié)軟骨組織形態(tài)紊亂，有血管充血及大量炎性細胞浸潤，部分樣本關節(jié)軟骨組織壞死，與空白組比較，評分有顯著性差異(P＜0.01)，提示模型復制成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后，各劑量組家兔關節(jié)軟骨組織血管充血、黏膜腫脹、炎細胞浸潤、組織壞死情況均有顯著的改善，差異具有顯著性(P＜0.05 或P＜0.01)。結果見表2 及圖1。

2.2 金鳳顆粒對家兔軟骨組織MMP-1、TIMP-1 表達影響 與空白組相比，模型組家兔關節(jié)軟骨組織MMP-1 表達水平顯著升高(P＜0.01)、TIMP-1 表達顯著降低(P＜0.01)，提示模型建立成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后，與模型組相比，高劑量組MMP-1 表達顯著降低(P＜0.05)，TIMP-1 表達增強(P＜0.01)。中劑量組MMP-1 的表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結果見表3，圖2、3。

表2 關節(jié)軟骨改變的組織學分級評分結果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

表2 關節(jié)軟骨改變的組織學分級評分結果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

表3 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

表3 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

圖1 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學影響(×400)Fig.1 Effect of Jinfeng granule on pathomorpholoy of rabbit articular cartilage tissue(×400)

圖2 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織MMP-1 表達的影響(×400)Fig.2 Effect of Jinfeng granule on expression of MMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

圖3 金鳳顆粒對家兔關節(jié)軟骨組織TIMP-1 表達的影響(×400)Fig.3 Effect of Jinfeng granule on expression of TIMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

3 討論

MMP-1 是細胞外基質降解最重要的蛋白系統(tǒng)，參與了痛風性關節(jié)炎關節(jié)組織創(chuàng)傷修復與重塑、炎癥反應等過程［11］。TIMP-1 是MMP-1 的天然拮抗劑，與活化的MMP-1 結合形成復合物，從而阻斷MMP-1 活性，維系MMP-1/TIMP-1 平衡［12］。有學者研究提示，MMP-1 活化濃度與關節(jié)炎癥密切相關，MMP-1/TIMP-1 失衡可能是痛風性炎癥病程中難以愈合的重要因素之一［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組家兔關節(jié)軟骨組織排列紊亂，血管充血及大量炎性細胞浸潤，部分樣本關節(jié)軟骨組織壞死，關節(jié)軟骨組織中MMP-1 顯著升高(P＜0.01)、TIMP-1 顯著下降(P＜0.01)，MMP-1/TIMP-1 失衡(P＜0.01)。提示機體受到MSU 晶體刺激后，MMP-1 表達增強，TIMP-1 不同程度的丟失或低表達，導致MMP-1/TIMP-1 失衡，對細胞外基質的降解能力增強，激活炎癥瀑布反應而出現(xiàn)關節(jié)軟骨組織嚴重充血、大量炎性細胞浸潤、明顯腫脹、壞死，而導致關節(jié)軟骨嚴重受損。

經(jīng)金鳳顆粒治療后，高劑量組MMP-1 得到明顯抑制(P＜0.01)，TIMP-1 表達明顯加強(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1 顯著降低(P＜0.01);中劑量組MMP-1 有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1趨向平衡(P＜0.05);病理形態(tài)學改變也得到明顯改善(P＜0.05 或P＜0.01)。研究結果提示，金鳳顆粒的作用機制可能與通過抑制MMP-1 高表達，加強TIMP-1 表達，調節(jié)MMP-1/TIMP-1 平衡，阻斷炎癥反應循環(huán)鏈，而實現(xiàn)其臨床療效。

綜上，金鳳顆粒能有效抑制痛風性關節(jié)炎的病理損害，其作用機制可能是與通過阻斷MMP-1 活性，恢復MMP-1/TIMP-1 失衡有關。

［1］黃雪芳.四妙散加味治療痛風性關節(jié)炎臨床應用［J］.中外醫(yī)療，2012，31(4):139.

［2］中華醫(yī)學會內分泌學分會.高尿酸血癥和痛風治療的中國專家共識［J］.中華內分泌代謝，2013，29(11):913-920.

［3］Monika Merkle，Andrea Ribeiro，Simone Koppel.TNF-α enhances TLR3 dependent effects on MMP-9 expression in human mesangial cells［J］.Cell Biol Int，2012，36(12):1155-1160.

［4］Thomas CM，F(xiàn)uller CJ，Whittles CE，et al.Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation［J］.Osteoarthr Cartil，2007，15(1):27-34.

［5］佟 穎，孟 潔，金 湯，等.痹寧膠囊對急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型IL-1 及MMP-9 的研究［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8(5):543-545.

［6］崔 炎，李玉鳳.崔公讓教授治療痛風性關節(jié)炎經(jīng)驗介紹［J］.新中醫(yī)，2009，41(10):12-13.

［7］王曉倩，李 鑫，郭建生，等.金苓痛風舒微丸對高尿酸血癥小鼠血尿孫、肌酐、尿素氮及黃嘌呤氧化酶活性的影響［J］.西北藥學雜志，2014，29(5):483-486.

［8］王曉倩，李 鑫，郭建生，等.金苓痛風舒微丸抗炎作用及其機制研［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25(6):700-704.

［9］Mc Cartney-Francis N，Allen JB，Mizel DI，et al.Superssion of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase［J］.J Exp Med，1993，1178(8):749-754.

［10］Jovanovic DVJ，Martel-Pelletier A，di Battista F，et al.Stimulation of 92-kd gelatinase(matrix metalloproteinase 9)production by interleukin-17 in human monocyte/macrophages:a possible role in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2000，43:1134-1144.

［11］談益芬，唐艷麗，王勝香，等.中藥組方NDRF 對佐劑性關節(jié)炎家兔滑膜MMP-3、VEGF 分子及其mRNA 的影響［J］.中國免疫學雜志，2014，30(1):57-60.

［12］Tyagi A.Agarwal C，Dwyer-Nield L，et al.Silibinin modulates TNF-alpha and IFN-gamma mediated signaling to regulate COX2 and iNOS expression in tumorigenic mouse lung epithelial LM2 cells［J］.Mol Carcinog，2012，51(10):832.

［13］Rathnayake N，Akerman S，Klinge B，et al.Salivary biomarkers of oral health:a cross-sectional study［J］.J Clin Periodontol，2013，40(2):140.