楊大剛 王 眾 王惠群 孫誠誼 (貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550004)

Plk1 是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，有誘導DNA 合成、DNA 完整性的檢修及防止細胞凋亡的作用。Plk1 與中心體復制，紡錘體形成，染色體分離以及胞質(zhì)分裂等有絲分裂期過程密切相關。當細胞周期檢測點啟動時，Plk1 通過降解細胞周期抑制蛋白weel，促使細胞進入新的細胞周期。當Plk1 突變或受外源性刺激干預后會失去其在有絲分裂期的正常功能并可以誘發(fā)細胞分裂紊亂，促使細胞發(fā)生癌變。此外，Plk1 可以通過抑制人線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)，調(diào)節(jié)具有抗病毒、抗腫瘤功能的IFN(Interferon，IFN)的生成，破壞先天性免疫［1］，降低機體對腫瘤的抵抗作用。

細胞周期檢測點激酶1、2(Check point kinase 1/2，Chk1/2)作為細胞周期檢測中關鍵的效應蛋白激酶，主要以S 期和G2/M 期為主要調(diào)控點，調(diào)控細胞周期的正常時序。當Chk1/2 表達異常時，引起基因組穩(wěn)定性下降、導致腫瘤發(fā)生，因此細胞周期檢測點與腫瘤細胞逃避凋亡的機制密切相關［2］。相對應的，當腫瘤細胞受到放化療殺傷，DNA 復制紊亂時，Chk1/2 也會幫助腫瘤細胞停止細胞周期進程并修復損傷，使其逃避放化療的殺傷。本研究通過了解Plk1、Chk1/2 在原發(fā)性肝癌組織及HepG2 細胞中的表達，以期為原發(fā)性肝癌的生物免疫治療治提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 組織來源 以手術切除并排除術前放、化療的病例資料完整的原發(fā)性肝癌石蠟標本40 例。其中17 例為高、中分化，23 例為低分化;年齡:34～71歲，中位年齡48 歲。同時分別隨機選取正常肝組織及肝硬化組織標本各8 例，該16 例組織標本經(jīng)病理診斷排除腫瘤病變，所有組織標本均由貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人Plk1 單克隆抗體、鼠抗人Chk1 單克隆抗體、鼠抗人Chk2 單克隆抗體及鼠單克隆β-actin 抗體均為美國Santa Cruz 公司生產(chǎn)。二步法免疫組化檢測試劑盒及DAB 顯色劑購自北京中杉金橋生物技術公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測蛋白表達 采用Envision 免疫組化二步法染色，具體步驟按試劑盒說明操作。將石蠟包埋組織4 μm 厚切片，常規(guī)二甲苯梯度脫蠟，酒精梯度脫水，高壓抗原修復，以PBS 替代一抗作陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷 采用雙盲法閱片，在光鏡下進行形態(tài)學觀察，陽性細胞指細胞核和細胞漿含淺灰色或者灰色、深灰色顆粒者;陽性率指高倍鏡(×400)下計數(shù)5 個視野內(nèi)100 個細胞的平均陽性細胞率;蛋白表達的由弱至強依次為:黑色0 分、淺灰色1分、灰色2 分、(棕)深灰色3 分;平均陽性率＜10%計0 分，10%～24% 計1 分，25%～49%計2 分，50%～74%計3 分，≥75%計4 分。綜合判定:取著色強度和陽性率分數(shù)之乘積:0 分記為(-)，1～2分記為(+)，3～4 分記為(++)，6～8 分記為(+++)，9～12分記為(++++);(-)和(+)判定為表達陰性，(++)～(++++)判定為陽性表達。

1.2.3 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細胞中表達的定性分析 采用Western blot 方法對Plk1、Chk1/2蛋白在HepG2 細胞中表達進行定性分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。應用Photoshop cs5.0 軟件測定每條條帶的平均灰度值和面積，并用平均灰度值減去背景灰度值所得的絕對灰度值×蛋白條帶所占面積作為目標條帶的最終灰度值。以目標蛋白和β-actin 蛋白最終灰度值相比所得的相對表達率為數(shù)據(jù)，檢驗不同基因蛋白表達的差異。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS19.00 進行數(shù)據(jù)處理分析，檢驗水準α=0.05。免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗，蛋白表達灰度值采用多組單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白的表達 如表1 及圖1 所示:40 例原發(fā)性肝癌組織中，Plk1、Chk1/2 的陽性例數(shù)分別為23 例、30 例和9 例，陽性表達率分別為57.5%、75.0% 和22.5%。16 例肝非腫瘤組織中Plk1、Chk1/2 的陽性分別為0 例、4 例和9 例，分別占總例數(shù)的0%，25.0%和56.3%。原發(fā)性肝癌組織中Plk1 和Chk1 表達陽性率均高于肝非腫瘤組織(P＜0.05)。而Chk2 在肝非腫瘤組織的表達高于在原發(fā)性肝癌組織中的表達(P＜0.05)。

2.2 HepG2 細胞中Plk1、Chk1/2 蛋白表達情況。

2.2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細胞中的表達如圖2 所示，三種激酶蛋白在HepG2 細胞中均有表達。

2.2.2 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 細胞中表達的半定量分析 如表2 所示，激活CDC25 磷脂酶，使細胞進入M期，啟動有絲分裂［3，4］。其缺失可能導致出現(xiàn)多中心體、多核細胞，發(fā)生姐妹染色體分離障礙等與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關的改變［5］。

表1 Plk1、Chk1/2 在原發(fā)性肝癌和肝非腫瘤組織中表達情況［n(%)］Tab.1 Expression of Plk1，Chk1/2 in primary liver cancer(PLC)and non-tumor liver tissue(NTL)［n(%)］

圖1 Plk1、Chk1/2 蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(SP，×400)Fig.1 Expression of Plk1，Chk1/2 protein in primary liver cancer tissue(SP×400)

圖2 HepG2 細胞中Plk1、Chk1/2 蛋白的表達Fig.2 Plk1，Chk1/2 proteins expression in HepG2 cells

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白與β-actin 總灰度值比較及各基因蛋白相對表達量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白與β-actin 總灰度值比較及各基因蛋白相對表達量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

Note:Relative expression=grey value of the protein/grey value of β-actin.1)P＜0.05 compared with Plk1;2)P＜0.01 compared with Chk1，Plk1.

Chk1/2 位于細胞周期檢測點激活途徑的末端，DNA 受到損傷時，Chk1/2 通過調(diào)控weel、14-3-3、CDC25 等相關蛋白，激活DNA 損傷檢測點，使細胞周期發(fā)生改變，滯留于G1/S、S 或G2/M 期，使受損DNA 自我修復［6］。

腫瘤細胞DNA 被破壞時，Chk1/2 可使其細胞周期暫停從而完成自我修復后逃避凋亡［7］。以Chk1/2 為作用靶點，可干擾腫瘤細胞的DNA 損傷修復機制，從而提高腫瘤治療的敏感性［8，9］。

3 討論

本研究結(jié)果顯示:Plk1、Chk1/2 激酶蛋白在原發(fā)性肝癌組織中均有表達，Plk1、Chk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達高于非腫瘤組織，而Chk2 在非腫瘤組織中的表達高于原發(fā)性肝癌組織，且差異均有統(tǒng)計學意義。Plk1 的表達和以往所報道的其在大多數(shù)人類惡性實體腫瘤中均有表達，并與某些腫瘤的生物學行為及預后相一致［10，11］。近些年也有國內(nèi)外研究表明Chk1 在一些惡性腫瘤中表達［11，12］。結(jié)合本實驗結(jié)果可以說明Plk1 與Chk1 具有相對意義的腫瘤選擇性表達，且Plk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達率為57.5%，而在所有的非腫瘤組織中均無表達;Chk1 在原發(fā)性肝癌組織中的表達率為75.0%，說明Plk1 與Chk1 可能是未來原發(fā)性肝癌治療的理想靶點。

Plkl、Chk1/2 蛋白在HepG2 細胞中均有表達，其表達強度為Plk1 ＞Chk1 ＞Chk2。這一點驗證了這三種基因在原發(fā)性肝癌治療中Plk1 及Chk1 作為靶點的特異性。HepG2 為人肝癌細胞，生長增殖旺盛，故其多處于M 期，而Plk1 激酶正發(fā)揮著細胞從分裂間期進入分裂期的“分子開關”作用。Chk1/2激酶作用于細胞分裂間期，故他們在HepG2 細胞中的表達水平低于Plk1，而Chk2 的表達最低，但明確其與腫瘤發(fā)生之間的相互關系尚需進一步研究。

Chk1 在細胞周期中的作用位置與Plk1 互補，幾乎作用于除M 期之外的G1 期、S 期、G2 期;Chk2則作用在G1 期與G2 期?？紤]到本實驗所研究的HepG2 細胞為人肝腫瘤細胞，處于對數(shù)生長期時分裂增殖數(shù)率很快，故其處于M 期的細胞數(shù)量較多，因此Plk1 在三種蛋白中的表達豐度最高。而Chk1是細胞處于細胞間期準備階段的重要蛋白，可以說在細胞間期發(fā)揮著許多決定性作用，為腫瘤細胞的分裂增殖提供了生物學保證。本研究結(jié)果顯示Chk2 在肝非腫瘤組織中的表達率高于原發(fā)性肝癌組織，說明Chk2 可能參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程，但其并非是關鍵蛋白，其與原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的關系尚待探索。

［1］Vitour D，Dabo S，Ahmadi Pour M，et al.Polo-like kinase 1(PLKl)regulates IFN induction by MAVS［J］.J Biol Chem，2009，284(33):21797-21809.

［2］Colnaghi R，Wheatley SP.Liaisons between survivin and Plk1 during cell division and cell death［J］.J Biol Chem，2010，285(29):22592-22604.

［3］Anna Santamaria，Bin Wang，Sabine Elowe，et al.The Plk1-dependent Phosphoproteome of the Early Mitotic Spindle［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10(1):M110.004457.

［4］Leo Studach，Wen-Horng Wang，Gregory Weber，et al.Polo-like kinase 1 activated by the hepatitis B virus X protein attenuates both the DNA damage checkpoint and DNA repair resulting in Partial polyploidy［J］.J Biol Chem，2010，285(39):30282-30293.

［5］He ZL，He Zheng，Hui Lin，et al.Overexpression of polo-like kinase1 predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients［J］.World J Gastroenterol，2009，15(33):4177-4182.

［6］Hiroyuki Niida，Kazuhiro Murata，Midori Shimada，et al.Cooperative functions of Chk1 and Chk2 reduce tumour susceptibility in vivo［J］.EMBO J，2010，29(20):3558-3570.

［7］Matsumoto K，Nagahara T，Okano J，et al.The growth inhibition of hepatocellular and cholangiocellular carcinoma cells by gemcitabine and the roles of extracellular signal-regulated and checkpoint kinases［J］.Oncol Rep，2008，20(4):863-872.

［8］王玉祥，祝淑釵，封 巍.CHK1 和CHK2 shRNA 轉(zhuǎn)染對食管癌細胞照射后G2 期阻滯的影響［J］.中華腫瘤雜志，2006，28(8):572-577.

［9］Varmark H，Kwak S，Theurkauf WE.A role for Chk2 in DNA damage induced mitotic delays in human colorectal cancer cells［J］.Cell Cycle，2010，9(2):312-320.

［10］黃 偉，張瑤珍，周劍鋒，等.Chk1/2 反義寡核苷酸對順鉑作用下K562 細胞凋亡的影響［J］.中國實驗血液學雜志，2004，12(5):563-567.

［11］黃曉園，高慶蕾，莊 亮，等.Chk1/2 和Plk1 蛋白在宮頸癌良惡性病變組織中的表達及其意義［J］.中國癌癥雜志，2007，17(6):429-432.

［12］Tang J，Yang X，Liu X.Phosphorylation of Plk1 at Ser326 regulates its functions during mitotic progression［J］.Oncogene，2008，27(52):6635-6645.