鄭曉丹 郭鈺琪 張洪海 王 雷 王 麗 李 霞 張巧鳳 郝 鈺 姚成芳

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南 250062)

放射免疫損傷是腫瘤放療病人面臨的常見問(wèn)題。隨著核能源的廣泛利用，放射對(duì)健康人群的威脅也引起重視。輻射(Irradiation，IR)可造成免疫系統(tǒng)的抑制或衰竭已成定論［1］，尤其對(duì)樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的損傷和修復(fù)關(guān)注較多［2］，但定量照射對(duì)T 細(xì)胞的影響結(jié)論較為復(fù)雜。T 淋巴細(xì)胞是高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體，其中，CD4+T 細(xì)胞依據(jù)細(xì)胞因子分泌模式可分為Th1、Th2、Th17、Treg 等多個(gè)細(xì)胞亞群，其多向免疫調(diào)節(jié)作用使其成為機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主導(dǎo)細(xì)胞，在機(jī)體抗病毒、抗菌和抗腫瘤等免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［3，4］。目前，有關(guān)T 細(xì)胞亞群應(yīng)對(duì)輻射的敏感性及其損傷后免疫重建模式尚無(wú)報(bào)道，因此，明確輻射損傷后T 細(xì)胞亞群免疫重建特征將為科學(xué)調(diào)控機(jī)體應(yīng)對(duì)輻射免疫損傷、建立抗病毒、抗腫瘤等免疫優(yōu)勢(shì)狀態(tài)提供新的策略。

山茱萸又名山萸肉、蜀棗、鼠矢等，主要生長(zhǎng)于我國(guó)浙江、河南、山東等，其味酸、澀，微溫，歸肝腎經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效［5］，是免疫調(diào)節(jié)的常用組方中藥。但山茱萸調(diào)節(jié)輻射損傷后免疫重建的作用尚不明了。本研究以放射損傷后小鼠為研究對(duì)象，探討了解T 細(xì)胞亞群免疫重建特點(diǎn)以及山茱萸的作用優(yōu)勢(shì)，為科學(xué)防治輻射誘導(dǎo)的T 細(xì)胞亞群免疫損傷和山茱萸的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，8 周齡，體重(20 ±2)g，購(gòu)于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%的超凈動(dòng)物柜。

1.2 藥物 山茱萸生品購(gòu)自山東省建聯(lián)中藥股份有限公司，經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院蔡生業(yè)教授鑒定為山茱萸的成熟干燥果肉。稱取適量的山茱萸制品，常規(guī)法水煎、醇沉、回收乙醇，制成含生藥0.857 g/ml 的原液，滅菌后4 ℃冰箱保存，用于小鼠灌胃給藥。

1.3 主要試劑與儀器 佛波酯(Phorbol myristate acetate，PMA)、離子霉素(Ionomycin)和蛋白轉(zhuǎn)錄抑制劑(BFA)均購(gòu)自Sigma 公司。小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，PE-CY5 標(biāo)記的CD3、CD25，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的CD4，PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的CD8，PE 標(biāo)記的IL-4、FoxP3，APC 標(biāo)記的IFN-γ，APC-CY7 標(biāo)記的IL-17A，均購(gòu)自BD 公司。FACS verse 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。Poch-100 iV Diff 全自動(dòng)血液分析儀購(gòu)自日本SYSMEX 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 C57BL/6 小鼠25 只，自由攝水飲食一周后，給予X 線照射。另有C57BL/6 小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組，每組10 只。正常對(duì)照組和照射模型組小鼠自由攝水、飲食。山茱萸組給予山茱萸水提液灌胃，7.5g/(kg·d)。一周后，照射模型組和山茱萸組給予X 線照射。

1.4.2 照射條件 使用瑞典醫(yī)科達(dá)全數(shù)字直線加速器(型號(hào)precise)對(duì)小鼠進(jìn)行全身照射，總照射劑量為2.6 Gy，劑量率1.3 Gy/min，照射距離為170 cm。

1.4.3 照射后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血常規(guī)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T、CD4+T、CD8+T 細(xì)胞 分別于照射前、照射后第3、5、8、10 天各處死5 只小鼠，收集抗凝血，血液分析儀檢測(cè)血常規(guī)。Ficoll 液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。分離小鼠脾臟，尼龍濾網(wǎng)研磨過(guò)濾脾細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。1 ×PBS 洗兩遍，室溫避光封閉Fc 受體30 min。根據(jù)說(shuō)明書向細(xì)胞懸液中加入流式外標(biāo)熒光抗體(CD3-PE-Cy5、CD4-FITC、CD8-PerCP-Cy5.5)，4 ℃避光孵育30 min，1 ×PBS 洗滌后，流式儀檢測(cè)并分析CD3+T、CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞的比例。

1.4.4 胞內(nèi)外染色法檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群 X 射線照射后第8 天頸椎脫臼處死小鼠。無(wú)菌分離小鼠脾臟，尼龍濾網(wǎng)研磨過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，RPMI-1640 調(diào)整細(xì)胞濃度至5 ×106ml-1，接種于24 孔板，每孔2 ml，加入PMA 30 ng/ml，lonomycin 1 μg/ml，BFA 1 μl/ml。37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)刺激培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞，1 ×PBS 洗兩遍，同上標(biāo)記細(xì)胞外標(biāo)熒光抗體(CD3-PE-Cy5、CD4-FITC、CD25-PECY5.5)，4℃避光孵育30 min，1 × PBS 洗兩遍，BD固定穿膜試劑盒和固定穿核試劑盒進(jìn)行穿膜或穿核(固定穿核檢測(cè)FoxP3)。穿膜/穿核緩沖液洗一遍，加入流式內(nèi)標(biāo)熒光抗體(PE 標(biāo)記的IFN-γ、IL-4 及FoxP3，APC-CY7 標(biāo)記的IL-17A)，4℃避光孵育30 min，穿膜/穿核緩沖液洗一遍，1 ×PBS 洗一遍，流式儀檢測(cè)并分析Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Tc1(CD3+CD4-IFN-γ+)、Th2 (CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17A+)及 Treg (CD4+CD25+FoxP3+)亞群的比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s 表示。多組間比較采用One Way ANOVA 方差分析，兩組間比較采用Turkey 法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞是對(duì)X 射線照射較為敏感的細(xì)胞群體 由血常規(guī)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白量(HGB)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板(PLT)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM)等指標(biāo)可見，在照射后第3 天，小鼠外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05，見表1)，是檢測(cè)指標(biāo)中應(yīng)對(duì)輻射損傷較為敏感的細(xì)胞群體。

2.2 X 線照射后CD3+/CD4+/CD8+T 細(xì)胞的變化特點(diǎn) T 細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的重要組成細(xì)胞，對(duì)輻射損傷極為敏感:流式結(jié)果顯示，外周血中CD3+T 細(xì)胞比例和數(shù)量在照射后第5 天顯著下降，第8 天開始上調(diào)，第10 天恢復(fù)至正常水平(圖1A、B);小鼠脾臟中CD3+T 細(xì)胞比例和數(shù)量(包括CD4+T、CD8+T 細(xì)胞)在照射后第3 天顯著下降，第8 天開始逐漸恢復(fù)(圖1A、C)。照射后第5 天，CD8+T 細(xì)胞比例上調(diào)，而CD4+T 細(xì)胞在第8 天上調(diào)，至第10天，兩者恢復(fù)近正常水平(圖1D、E)。

表1 X 射線照射前后小鼠外周血血常規(guī)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s)Tab.1 Changes of bloodroutine of mice before or after irradiation(±s)

表1 X 射線照射前后小鼠外周血血常規(guī)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s)Tab.1 Changes of bloodroutine of mice before or after irradiation(±s)

Note:Compared with day 0，1)P＜0.05.

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)X 射線照射后CD3 +、CD4 +和CD8 +T 細(xì)胞的增殖狀態(tài)Fig.1 Proliferation of CD3 +，CD4 + and CD8 + T cells measured by flow cytometry after X-ray irradiation

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中CD3 +CD4 +IFN-γ+ Th1 細(xì)胞和CD3 +CD4-IFN-γ+ Tc1 細(xì)胞比例Fig.2 Expressions of CD3 +CD4 +IFN-γ+ Th1 cells and CD3 +CD4 -IFN-γ+ Tc1 cells in spleen measured by flow cytometry

2.3 X 線照射后Th1/Th2 細(xì)胞亞群的免疫重建特點(diǎn) 在T 細(xì)胞免疫重建過(guò)程中(照射后第8 天)，不同功能的T 細(xì)胞亞群重建能力不同，其中，Th1 亞群重建能力較弱，照射組小鼠Th1 亞群的比例和數(shù)量仍明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05，圖2A、B、C);Tc1亞群(CD3+CD4-IFN-γ+T)的比例和數(shù)量也顯著下降(P＜0.05，圖2D、E、F);Th2 亞群比例顯著增加(P＜0.01，圖3)。

2.4 X 線照射后Th17/Treg 亞群的優(yōu)勢(shì)狀態(tài) 隨著T 細(xì)胞總體水平的升高，輻射組小鼠Th17 亞群占CD4+T 的比例明顯增加(P＜0.05，圖4);輻射組小鼠Treg 亞群的比例也明顯上升(P＜0.01，圖5)。

2.5 山茱萸調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群免疫重建作用 與輻射模型組相比，山茱萸處理小鼠Th1 亞群的比例明顯上調(diào)(P＜0.01，圖2B);Tc1 亞群亦有升高趨勢(shì)(圖2E、F);Th2 亞群的比例和細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(P＜0.05，圖3);Th17 亞群數(shù)量明顯減少(P＜0.05，圖4);Treg 亞群比例顯著下降(P＜0.05，圖5)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中CD3 +CD4 +IL-4 + Th2 細(xì)胞比例Fig.3 Expressions of CD3 +CD4 +IL-4 + Th2 cells measured by flow cytometry in spleen

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中CD3 +CD4 +IL-17A +Th17 細(xì)胞比例Fig.4 Expressions of CD3 +CD4 +IL-17A + Th17 cells measured by flow cytometry in spleen

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中CD4 +CD25 +Foxp3 +Treg 細(xì)胞比例Fig.5 Expressions of CD4 +CD25 +Foxp3 +Treg cells measured by flow cytometry in spleen

3 討論

T 細(xì)胞是高度異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞群體，其中，Th1、Th2、Th17、Treg 等細(xì)胞亞群因細(xì)胞因子分泌模式不同而功能迥異:Th1 細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-β、IL-2 等，主導(dǎo)細(xì)胞免疫，在機(jī)體抗病毒、抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5 等細(xì)胞因子，主導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，具有抗毒素的作用。最近有研究表明，Th2 型細(xì)胞因子與某些炎癥損傷有關(guān)［6］。Th17 細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E 等炎性因子參與機(jī)體的多種炎性反應(yīng)。Treg 可通過(guò)分泌TGF-β 等細(xì)胞因子負(fù)向調(diào)控Th1/Th2 亞群的活化［7］。T 細(xì)胞各亞群相互促進(jìn)、相互限制，共同打造機(jī)體的免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在遭遇電離輻射時(shí)，不同T 細(xì)胞亞群在應(yīng)對(duì)輻射損傷時(shí)的敏感性和輻射后的重建能力差異直接影響機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，T 細(xì)胞亞群失衡會(huì)削弱機(jī)體的免疫力，引發(fā)腫瘤、心血管病和甲狀腺疾病等［8］。因此，T細(xì)胞成為輻射免疫損傷評(píng)價(jià)和疾病預(yù)防的重要靶細(xì)胞，特別是在腫瘤放療過(guò)程中，如何根據(jù)不同T 細(xì)胞亞群免疫重建特點(diǎn)，有效調(diào)控和促進(jìn)Th1 亞群優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，將直接影響機(jī)體抗腫瘤的能力建設(shè)。Kachikwu等［9］已證實(shí)了Treg 細(xì)胞作為一種介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的免疫抑制細(xì)胞，在小鼠受到輻射后會(huì)明顯增多，卻并未對(duì)CD4+T 細(xì)胞其他亞群的變化特點(diǎn)進(jìn)行闡述。而本研究在明確輻射后淋巴細(xì)胞顯著變化的同時(shí)，進(jìn)一步闡明了T 細(xì)胞各亞群輻射后免疫重建特點(diǎn)和其功能性細(xì)胞因子的重建能力差異。

本研究中，外周血血常規(guī)指標(biāo)的變化證實(shí)了淋巴細(xì)胞對(duì)輻射損傷的高度敏感性。并進(jìn)一步證實(shí)了T 細(xì)胞是淋巴細(xì)胞遭受輻射損傷的主體。輻射后CD8+T 細(xì)胞免疫重建能力較強(qiáng)是本研究的新發(fā)現(xiàn)。T 細(xì)胞的分化發(fā)育和功能離不開TCR 主導(dǎo)的第一信號(hào)的驅(qū)使，即與MHC-肽復(fù)合物密切相關(guān)。機(jī)體在靜息狀態(tài)下，CD8+T 細(xì)胞所識(shí)別MHCⅠ分子相關(guān)肽復(fù)合物(MHC-associated peptides，MIPs)主要來(lái)源于自身MIPs (self MHC Ⅰ immunopeptidome，SMII)，以維持CD8+T 分化或活化。輻射損傷后可引起體內(nèi)SMII 急劇升高［10］，這可能是CD8+T 細(xì)胞較CD4+T 細(xì)胞較早開始免疫重建的重要原因之一(圖1D、E)。另外，T 細(xì)胞免疫重建始于單次照射后5～8 d，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)為臨床如何利用機(jī)體自身的免疫修復(fù)能力科學(xué)選擇腫瘤放療頻率和時(shí)間提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

另外，CD4+T 細(xì)胞在照射后增殖過(guò)程中，Th1、Th2、Th17、Treg 的免疫重建能力仍處于失衡狀態(tài)。表現(xiàn)為具有抗腫瘤、抗病毒功能的Th1 亞群處于劣勢(shì)狀態(tài)，而免疫炎性或抑制性Th2、Th17、Treg 亞群依然處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)(圖2～5)，這可能也是輻射后炎性疾病、腫瘤復(fù)發(fā)、心血管等疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。因此，掌握T 細(xì)胞亞群輻射后免疫重建特點(diǎn)，針對(duì)性提高處于劣勢(shì)的Th1 細(xì)胞群體，抑制Th17、Treg、Th2 的過(guò)度增殖，有利于促進(jìn)輻射后免疫重建過(guò)程中T 細(xì)胞亞群的平衡建設(shè)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，提高免疫整體實(shí)力，避免疾病的發(fā)生發(fā)展，也是防治輻射類疾病和腫瘤復(fù)發(fā)的重要途徑和策略。

山茱萸是滋補(bǔ)類中醫(yī)處方的常用配伍中藥，具有抗腫瘤功效［11］，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著促進(jìn)輻射損傷后Th1 亞群的免疫重建，抑制Th2、Th17 和Treg亞群過(guò)度增殖。這一結(jié)果顯示山茱萸對(duì)輻射誘導(dǎo)的免疫炎性疾病具有潛在應(yīng)用價(jià)值，尤其對(duì)T 細(xì)胞亞群的選擇性調(diào)節(jié)作用有利于輻射損傷后免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重建，其機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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