尹炳謙 賈繼宗 趙風(fēng)強(qiáng) 韓金樂 黃承浩 葉祥忠 張景海

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016)

單純皰疹病毒-1(HSV-1)是引發(fā)人口唇部皮膚、口腔黏膜感染、引起發(fā)熱等的病原體，屬于皰疹病毒科a 病毒亞科的成員，可通過呼吸道、皮膚和黏膜密切接觸傳播。HSV-1 宿主范圍廣，感染效率高，具有嗜神經(jīng)性，HSV-1 可潛伏和激活，引發(fā)潰瘍、發(fā)熱等，嚴(yán)重影響健康。

HSV-1 病毒顆粒直徑約為180 nm，由包膜、皮層和核衣殼組成的雙鏈DNA 病毒。HSV-1 基因組大小為152 kb，可操作空間大，可缺失突變，也可被改造為外源基因的載體，用于治療藥物研究，目前重組HSV-1 已應(yīng)用于腫瘤治療中。缺失ICP34.5 的HSV-1 喪失嗜神經(jīng)毒性且不影響其復(fù)制［1］，為其改造成減毒活疫苗或腫瘤治療藥物打開了視窗。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸還原酶基因突變的重組HSV-1，如核糖核苷還原酶(RR，ICP6)缺失［2］，僅能在具有增殖能力的細(xì)胞中增殖，如在腫瘤細(xì)胞中增殖并抑殺腫瘤細(xì)胞。通過插入特異性啟動(dòng)子控制HSV-1 復(fù)制所必需的立即早期基因如ICP4、ICP27 等，使其靶向性感染目標(biāo)細(xì)胞。另外，向重組HSV-1 中插入免疫調(diào)節(jié)因子如IL-12、GM-CSF 或B7-1 等基因［3］，可增強(qiáng)其溶瘤效應(yīng)。通過基因工程技術(shù)改造得到安全性好、靶向性強(qiáng)、復(fù)制效率高、可調(diào)控的重組HSV-1，使其作為抗腫瘤藥物成為可能［4］。目前多個(gè)溶瘤HSV-1 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并在腫瘤治療方面取得較理想的結(jié)果［5］。

本文介紹一種針對(duì)HSV-1 糖蛋白中和表位的、靈敏、準(zhǔn)確和特異的雙抗體夾心定量檢測HSV-1 抗原的ELISA 方法，為重組HSV-1 疫苗或溶瘤HSV-1藥物的研制提供一種快捷的抗原定量檢測的方法，可加速藥物研發(fā)進(jìn)程或提高質(zhì)控水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 抗體及參考品 HSV-1 單克隆抗(1F6、2B1)由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司制備并保存?？乖繀⒖计酚杀本┤f泰生物藥業(yè)股份有限公司制備并保存。

1.1.2 檢測樣品 單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、巨噬細(xì)胞病毒(CMV)、柯薩奇病毒A 組16 型(CA16)、人腸道病毒71 型(EV71)、甲型肝炎病毒(HAV)由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司保存。

1.1.3 細(xì)胞 ARPE 細(xì)胞，來自ATCC，由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司保存。

1.1.4 其他試劑 牛血清白蛋白(BSA)、辣根過氧化物酶(HRP)購自Sigma 公司;BCA 試劑購自pierce 公司;HRP 標(biāo)記的單克隆抗體由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司制備;硝酸纖維素膜購自whatman 公司。

1.2 單克隆抗體制備HSV-1 病毒顆?？乖c弗氏佐劑按1∶1乳化后，經(jīng)腹腔接種SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，100 μg/只，每2 周加強(qiáng)免疫1 次，50 μg/只/次，共免疫4 次，最后1 次經(jīng)尾靜脈注射HSV-1 抗原，100 μg/只，3 天后摘取脾臟并分離脾細(xì)胞。免疫的脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按PEG 方法融合，通過間接法篩選分泌抗HSV-1 抗體的雜交瘤細(xì)胞，并經(jīng)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)。腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，制備腹水。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀、Protein A 柱純化得到單克隆抗體。

1.3 單抗分析

1.3.1 SDS-PAGE 分析 用12%的聚丙烯酰胺分離膠，按90 V、30 min，120 V、45 min，對(duì)純化后的單抗2B1 和1F6 進(jìn)行SDS 變性凝膠電泳作純度分析。

1.3.2 Western blot 分析 將用293 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的HSV-1 的各種糖蛋白(gB～gK)經(jīng)SDSPAGE 后于90 V、100 mA 下電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，膜于4℃用5%脫脂牛奶封閉過夜。次日加入合適稀釋度的單抗，于37℃搖動(dòng)1 h，用PBST 洗滌，5 min/次，洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體，于37℃搖動(dòng)1 h，用PBST 洗滌，5 min/次，洗滌3次，加AEC 顯色。其中HSV-1 感染的ARPE 細(xì)胞為陽性對(duì)照，ARPE 細(xì)胞蛋白為陰性對(duì)照。

1.3.3 ELISPOT 分析 將每毫升1 ×105 U2OS 細(xì)胞接種到96 微孔細(xì)胞板中，于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24 h 后，轉(zhuǎn)染11 種糖蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h 之后用ELISPOT 檢測，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。在微孔中加入50 μl 的1%的多聚甲醛，室溫避光5 min;1 × PBS 洗滌微孔1 次，每孔加入100 μl 的0.1%Triton 室溫下處理5 min;用1 ×PBS 洗滌微孔1 次，加入單克隆抗體，100 μl/孔，37℃孵育1 h;用1 ×PBS 洗滌微孔5 次，加入GAM-HRP 二抗，37℃孵育30min;用1 ×PBS 洗滌微孔5 次，加入TMB 顯色液，37℃孵育15 min，肉眼觀察斑點(diǎn)。

1.4 雙抗體夾心ELISA 法的建立 通過方陣實(shí)驗(yàn)確定包被單抗1F6 和HRP 標(biāo)記單抗2B1 的最佳使用濃度，用正交試驗(yàn)、平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選樣品稀釋液、酶稀釋液和封閉液［6］。單抗1F6 用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到3 μg/ml，包被96 孔酶標(biāo)板，100 μl/孔，37℃溫育2 h，包被板用PBST(T為0.05% Tween20)洗滌1 次，用含2%BSA 的10 mmol/L PB 封閉液于37℃封閉2 h，用樣品稀釋液作2 倍比系列稀釋的樣品加入微孔中，100 μl/孔，37℃溫育60 min，用PBST 洗滌微孔，300 μl/孔，洗滌5 次，加HRP 標(biāo)記的2B1，100 μl/孔，37℃溫育45 min，用PBST 洗滌微孔，300 μl/孔，洗滌5 次，加TMB 顯 色 液，100 μl/孔，37℃溫 育15 min，加2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μl/孔，用450/630 讀微孔光密度值。

1.5 性能分析 根據(jù)《中華人民共和國藥典》三部(2010 版)對(duì)檢測方法驗(yàn)證的要求［7］，對(duì)本試劑的線性、準(zhǔn)確性、精密度、特異性等性能進(jìn)行分析。

1.5.1 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 用樣品稀釋液稀釋HSV-1 抗原內(nèi)部參考品為高值(2 μg/ml)、中值(1 μg/ml)、低值(0.5 μg/ml)3 個(gè)濃度后，用本方法測定。每個(gè)濃度樣品作3 份重復(fù)檢測，計(jì)算稀釋參考品的測定值和理論標(biāo)示值的比值，即回收率，分析本方法的準(zhǔn)確性。

1.5.2 精密性試驗(yàn) 對(duì)高值(2 μg/ml)、中值(1 μg/ml)、低值(0.5 μg/ml)3 個(gè)濃度的HSV-1 抗原稀釋參考品，3 人次進(jìn)行獨(dú)立試驗(yàn)，每一稀釋度作3份重復(fù)測定。比較測定值和真實(shí)值，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析試劑精密性。

1.5.3 直線性和定量限度實(shí)驗(yàn) 用樣品稀釋液將HSV-1 抗原參比品稀釋到2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/ml 后，用本方法測定。以抗原濃度和對(duì)應(yīng)的OD值作直線回歸分析，分析最佳線性范圍，確定定量限度。

1.5.4 特異性試驗(yàn) 用本方法分別檢測病毒培養(yǎng)液、ARPE 細(xì)胞蛋白、CMV、VZV 等，分析本試劑的特異性。

1.6 與病毒滴度相關(guān)性分析 HSV-1 純化的不同收集峰和不同批次的目標(biāo)峰分別用本方法檢測各樣品的HSV-1 抗原活性，同時(shí)用蝕斑法檢測各個(gè)樣品的病毒滴度。通過比較兩種方法的檢測結(jié)果，分析本方法檢測與病毒滴度的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體篩選 根據(jù)抗體滴度、特異性、中和效價(jià)、表位類型和配對(duì)檢測HSV-1 的靈敏度，篩選到兩株用于試劑構(gòu)建的單抗。兩株單抗的特征見圖1～3 和表1。

圖1 HSV-1 單抗的SDS 還原型凝膠電泳Fig.1 SDS-PAGE of monoclonal antibody against HSV-1

2.2 雙抗體夾心方法的建立 單抗1F6 用50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到3.0 μg/ml包被96 孔板，100 μl/孔，37℃溫育2 h 后，棄液;封閉，200 μl/孔，37℃溫育2h，棄液;加樣，100 μl/孔，37℃溫育1 h;洗板5 次，加酶標(biāo)抗體工作液，100 μl/孔，37℃溫育45 min，洗板5 次，加TMB 顯色液，100 μl/孔，37℃溫育15 min，加2 mol/L H2SO4終止液，50 μl/孔。用450/630 雙波長讀A 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬定標(biāo)準(zhǔn)方程，代入樣品的A 值，計(jì)算待檢品抗原活性值。

2.3 性能分析

2.3.1 準(zhǔn)確性和精密性 待檢品的回收率均值介于85.6%～107.1% 之間，同一試驗(yàn)重復(fù)檢測和不同試驗(yàn)者檢測的變異系數(shù)＜10%。準(zhǔn)確性和精密度分析結(jié)果如表2 所示。

圖2 HSV-1 單抗的Western blot 分析Fig.2 Western blot of monoclonal antibody against HSV-1

圖3 HSV-1 單抗的表位鑒定(ELISPOT 法)Fig.3 The epitope identification of the monoclonal antibody against HSV-1

表1 兩株單抗的特性Tab.1 Characteristics of two HSV-1 monoclonal antibodies

2.3.2 線性和定量限度 用本方法測定抗原內(nèi)部參比品的線性范圍為0.125～2 μg/ml、R2=0.995 5，定量限度為0.125 μg/ml，見圖4。

2.3.3 特異性試驗(yàn) 用建立的方法測定非HSV 樣品，待 檢 樣 品 的 A450/630 均 小 于 Cutoff 值(0.105)，即無交叉反應(yīng)。表明該檢測試劑的特異性良好。

2.3.4 與病毒滴度相關(guān)性分析 本方法檢測純化過程不同峰和不同批次目標(biāo)峰的抗原活性與蝕斑法檢測的病毒滴度的相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見圖5。

表2 方法的準(zhǔn)確性及精密性Tab.2 Accuracy and precision of developed ELISA method

圖4 HSV-1 抗原內(nèi)部參比品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of internal reference of HSV-1 antigen

圖5 兩種檢測方法的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of two detection methods

3 討論

經(jīng)過基因工程改造的重組HSV-1 能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞中大量增殖并最終殺死腫瘤細(xì)胞。美國Amgen 公司溶瘤免疫療法T-Vec 治療黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗(yàn)取得積極數(shù)據(jù)［8］，并且與施貴寶的Yervoy 聯(lián)合免疫治療黑色素瘤I 期研究中效果顯著，而且未表現(xiàn)出毒性［9］。德國Medigene 公司開發(fā)的NV1020 用于治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移性肝癌，在I/II期臨床中取得了安全和療效數(shù)據(jù)，患者一年生存率可達(dá)到47.2%［10，11］。Feng 等［12］構(gòu)建了一種新型HSV-1 重組溶瘤病毒KTR27，即刪除了HSV-1 在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的ICP0 基因，同時(shí)，增加了四環(huán)素調(diào)控ICP27 基因，使病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制嚴(yán)格受四環(huán)素調(diào)控，且重組病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制比在正常細(xì)胞更高效。重組HSV-1 已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療研究中，故開發(fā)一種快速檢測重組HSV-1的方法對(duì)加快重組HSV-1 工藝研究和提高重組HSV-1 質(zhì)量具有重要價(jià)值。

經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒疫苗或治療藥物是病毒制劑制備的主要方式，其中，就病毒制劑而言，顆粒性病毒是基礎(chǔ)。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中產(chǎn)生多種組裝形式［13-15］，如完整病毒顆粒、無核酸的空心顆粒、病毒亞單位等。不同制備工藝產(chǎn)生的各種組裝比例有較大差別，提高顆粒病毒產(chǎn)率是病毒制備工藝優(yōu)化的方向。完整病毒量可以通過細(xì)胞培養(yǎng)法檢測病毒滴度加以判定，但是存在周期長、通量小、成本高、技術(shù)要求高等不足［16］。PCR 法檢測雖然靈敏度高，但是，樣本易污染導(dǎo)致假陽、成本也比較高、且不能反映病毒顆粒性，不能用于病毒顆粒的質(zhì)控［17］。ELISA 法具有簡潔、準(zhǔn)確、快速、通量大等特點(diǎn)，可根據(jù)需要開發(fā)出針對(duì)亞單位、顆粒抗原的檢測試劑，用于工藝優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)控。

本文所用的兩株單抗是用純化的病毒顆粒免疫小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞，由雜交瘤細(xì)胞分泌的，單抗由病毒顆粒及其經(jīng)熱變性的病毒經(jīng)差減篩選獲得的，僅與病毒顆粒反應(yīng)。綜合Western blot 和ELISPOT 結(jié)果可得1F6 是針對(duì)gB 糖蛋白的構(gòu)單抗，2B1是針對(duì)gC 糖蛋白的單抗，且gC 和gB 之間沒有相互作用［18，19］，只有病毒在形成顆粒時(shí)才能通過這對(duì)抗體的雙抗體夾心檢測出來，所以，這兩株單抗是檢測病毒顆粒的且本方法檢測的病毒抗原活性與蝕斑法檢測的病毒滴度具有很好的相關(guān)性，r=0.93，據(jù)此推測本方法可初步用于病毒制備的顆粒檢測甚或病毒滴度檢測，為加快重組HSV-1 的工藝研究進(jìn)程提供了快速檢測方法。

［1］Anthony Orvedahl，Diane Alexander，Zsolt Tallóczy，et al HSV-1 ICP34.5 Confers Neurovirulence by Targeting the Beclin 1 Autophagy Protein［J］.Cell Host ＆ Microbe，2007，1(1):23-35.

［2］L Miao，C Fraefel，K C Sia，et al The potential application of a transcriptionally regulated oncolytic herpes simplex virus for human cancer therapy［J］.Br J Cancer，2014，110(1):94-106.

［3］Jacqueline N.Parkera，Luz-Andrea Pfistera，Debra Quenellea，et al Genetically engineered herpes simplex viruses that express IL-12 or GM-CSF as vaccine candidates ［J］.Vaccine，2006，24(10):1644-1652.

［4］William F.Goins，Shaohua Huang，Justus B.Cohen，et al Engineering HSV-1 Vectors for Gene Therapy ［J］.Methods Mol Biol，2014，1144:63-79.

［5］Manservigi R，Argnani R，Marconi P.HSV recombinant vectors for gene therapy［J］.Open Virol J，2010，4:123-156.

［6］賈繼宗，韓金樂，楊 亮，等.柯薩奇病毒A 組16 型抗原的ELISA 定量檢測方法建立［J］.中國免疫學(xué)雜志，2012，28:351-354.

［7］國家藥典編輯委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京:北京醫(yī)藥科技出版社，2010:2271-2284.

［8］Robert Hans Ingemar Andtbacka，F(xiàn)rances A.Collichio，Thomas Amatruda，et al.OPTiM:a multicenter，randomized phase 3 trial of talimogene laherparepvec versus subcutaneous GM-CSF for the treatment of unresected stage IIIB/C and IV melanoma:FC-022［J］.J Deut Derma Gesellschaft，2013，11(7):8.

［9］Igor Puzanov，Mohammed Milhem，Robert Andtbacka，et al.Phase 1 results of a phase 1b/2，multicenter，open-label trial to evaluate safety and efficacy of talimogene laherparepvec(T-VEC)and ipilimumab(ipi)vs ipi alone in previously untreated，unresected stage IIIB-IV melanoma［J］.J Immunother，2013，1(1):84.

［10］Sze DY，Chari R，Geller D，et al Abstract No.62:Phase I/II study of the oncolytic herpes virus NV1020 to treat liver-dominant metastatic colorectal cancer［J］.J Vasc Interve Rad，2008，19(2):25-26.

［11］Geevarghese SK，Geller DA，Haan HA，et al.Phase I/II study of oncolytic herpes simplex virus NV1020 in patients with extensively pretreated refractor colorectal cancer metastatic to the liver［J］.Human Gene Therapy，2010，21(9):1119-1128.

［12］Feng Yao，Nao Murakami，Oliver Bleiziffer，et al.Development of a regulatable oncolytic herpes simplex virus type 1 recombinant virus for tumor therapy ［J］.J Virology，2010，84 (16):8163-8171.

［13］Bataille D，Epstein AL.Herpes simplex virus type 1 replication and recombination［J］.Biochimie，1995，77(10):787-795.

［14］Mateu MG.Assembly，stability and dynamics of virus capsids［J］.Arch Biochem Biophys，2013，531(1-2):65-79.

［15］Seyffert M，de Oliveira AP，F(xiàn)raefel C，et al Multifluorescence live analysis of herpes simplex virus type-1 replication［J］.Methods Mol Biol，2014，1144:235-247.

［16］Michael Costello MT，Sabatinl L，Yungbluth P.Herpes simplex virus infections and current methods for laboratory detection［J］.Clinical Microbiology Newsletter，2006，28(24):185-192.

［17］Slomka MJ，Emery L，Munday PE，et al.A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes［J］.J Med Virol，1998，55(2):177-183.

［18］Gallagher John R，Atanasiu Doina，Saw Wan Ting，et al.Functional fluorescent protein insertions in herpes simplex virus gB report on gB conformation before and after execution of membrane fusion［J］.PLoS Pathogens，2014，10(9):1-16.

［19］Frink RJ，Eisenberg R，Cohen G，et al Detailed analysis of the portion of the herpes simplex virus type 1 genome encoding glycoprotein C［J］.J Virol，1983，45(2):634-647.