康月茜 張春燕 穆柳青 盧 楠 楊 春 李岱容

(重慶醫(yī)科大學病原生物學教研室與腫瘤研究中心，重慶 400016)

全世界約有三分之一人口感染結核分枝桿菌(Mycobacterium，tuberculosis，Mtb)，每年大約有150萬人死于結核病(Tuberculosis，TB)，TB 是繼艾滋病之后的第二大病原體殺手［1］。近年來由于多重耐藥(MDR-Mtb)和廣泛耐藥(XDR-Mtb)的菌株的不斷增多使結核病控制更加嚴峻［2］。因此尋找高效穩(wěn)定的檢測方法和研發(fā)有效的疫苗對控制結核病的傳播具有重要的意義［3，4］。Clp 蛋白酶廣泛存在于真核生物和原核生物中［5］，由水解蛋白的多聚體和調節(jié)亞基組成［6］。絕大多數(shù)細菌僅含有一種ClpP肽酶，而Mtb 中Clp 系統(tǒng)則由兩旁系同源基因ClpP1和ClpP2 組成。它們共轉錄表達，形成活性蛋白水解復合物發(fā)揮生物學作用［7，8］，在Mtb 發(fā)病機制中起著至關重要的作用［9-12］。本研究克隆、表達、純化Mtb Rv2460c 編碼的ClpP2 蛋白，評價了ClpP2 免疫學特性，為后續(xù)深入研究兔抗ClpP2 多克隆抗體的生物功能，驗證ClpP2 作為診斷靶標，藥靶候選蛋白的可行性提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物1～1.5 kg 雄性新西蘭白兔［合格證號:SYXK(渝2012-0001)］4 只，購于重慶醫(yī)科大學動物中心。所有的動物實驗根據(jù)重慶醫(yī)科大學相應的動物倫理委員會的綱要完成。

1.1.2 菌株 M.bovis BCG strain Pasteur(Mexico)為本實驗室保存，Escherichia coli TOP10 感受態(tài)細菌，Escherichia coli BL21(DE3)來源于Novagen。

1.1.3 病人血清 在本研究中所用健康人和結核病人血清標本均來自于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院。

1.1.4 主要試劑 細菌基因組DNA 小量純化試劑盒、DNA marker DL2000、高保真PCR 多聚酶、限制性內(nèi)切酶KpnI 與HindⅢ、膠回收試劑盒與DNA 連接試劑盒(TaKaRa 公司，日本);質粒提取試劑盒(OMEGA 公司，美國);蛋白分子量標準(Fermentas公司，加拿大);異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Ampicillin sodium)(鼎國昌盛生物技術有限責任公司，北京);SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所，上海);Ni2 +-His 標簽蛋白純化試劑盒，BCA 蛋白定量試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，北京);弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑(Sigma 公司，美國);鼠抗His 抗體、HRG 標記的山羊抗兔IgG、HRG 標記的山羊抗小鼠IgG、DAB 顯色試劑盒(中杉金橋生物技術有限公司，北京)。

1.2 方法

1.2.1 ClpP2-pET32a(+)原核表達質粒的構建和鑒定 根據(jù)Mtb.H37Rv 的Rv2460c 基因序列設計引物:5' GGGGTACCGTGAATTCCCAAAATTCT 3'(下劃線為KpnI 酶切位點)和5' CCCAAGCTTTCAGGCGGTTTGCG3'(下劃線為HindⅢ酶切位點)。Mtb.H37Rv DNA 為模板擴增Rv2460c 開放讀碼框(編碼ClpP2 蛋白，645 bp)片段，將純化PCR 產(chǎn)物克隆到pET32a 載體的KpnⅠ和HindⅢ位點，構建ClpP2 重組質粒［ClpP2-pET32a(+)］，并用雙酶切和DNA 測序法進行驗證。

1.2.2 rClpP2 的誘導表達和可溶性分析 然后將重組質粒ClpP2-pET32a(+)用化學方式轉化到BL21(DE3)用于ClpP2 的表達。挑取LA 培養(yǎng)板上成功轉化的BL21 細菌單菌落，接種至3 ml LA 培養(yǎng)基中，在37℃下，180 r/min 培養(yǎng)12～16 h，取100 μl 菌液至2 ml 的LB 中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)3 h，直到OD600 達到0.6～0.8。用濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導該蛋白的表達，誘導時間為2 h。誘導的大腸桿菌BL21 細胞在4℃10 min 離心5 000 r/min的條件下收獲沉淀，然后通過超聲讓誘導菌在裂解緩沖液中完全懸浮。然后置于冰上，功率300W，超聲破碎3 s，間隔3 s 條件下進行超聲碎菌，總時間20～25 min。超聲波破菌后，離心，取沉淀及上清做SDS-PAGE 電泳分析，顯示目標蛋白主要以包涵體形式表達。

1.2.3 Western blot 鑒定表達產(chǎn)物 表達產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE 后，電轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入以1∶1 000 稀釋的鼠抗His 抗體，4℃孵育過夜;PBST 洗滌，加入以1∶2 500稀釋HRP 標記羊抗鼠IgG，室溫作用1 h;PBST 洗滌，DAB 觀察顯色結果。

1.2.4 rClpP2 純化 將誘導后重組菌經(jīng)超聲破碎后離心(4℃，10 000 r/min，30 min)收集沉淀。洗滌的沉淀用1 ×binding buffer 洗2 次(10 000 r/min，4℃，20 min)。洗滌后的沉淀用含有8 mol/L 尿素的1 ×binding buffer 重懸裂解，冰浴1 h，間斷混勻數(shù)次，直至溶液變清涼。4℃，10 000 r/min，15 min 離心收集上清用用0.45 μm 濾膜過濾。將rClpP2 液負載上注純化，在變性條件下(含有8 mol/L 尿素的1 ×bingding buffer)使用Ni2+-Agarose His 標簽的蛋白純化系統(tǒng)對rClpP2 蛋白進行純化，嚴格按照操作說明書進行。

然后在4℃使用尿素的濃度梯度(6、4、2、0 mol/L)透析法去除尿素。蛋白質濃度使用BCA蛋白測定試劑盒測定，牛血清白蛋白(BSA)作為標準然后根據(jù)說明書使用。

1.2.5 anti-rClpP2 兔血清的制備 選取1～1.5 kg雄性新西蘭白兔4 只，對照組和實驗組各2 只，免疫前抽取其血清為陰性對照。對照組和實驗組分別注射生理鹽水和乳化后的重組蛋白rClpP2(0.5 mg/只)，采用背部、腹股溝及腳墊等多點注射，每2 周免疫一次，最后一次只免疫沒有乳化的重組蛋白，共免疫4 次，第4 次免疫1 周后進行心臟采血，收集血清，-80℃保存。將純化的重組蛋白包被酶標板，以等比稀釋的兔血清為一抗，HRP 羊抗兔IgG 為二抗，用ELISA 法測定兔血清效價。當OD 陽/OD 陰值＞2.1 對應的多克隆抗體最大稀釋濃度即為該抗體的效價。

1.2.6 Mtb ClpP2 蛋白表位預測 利用網(wǎng)站的VaxiPred 軟件對Mtb Clpp2 蛋白表位進行預測:B 細胞表位預測網(wǎng)站為 http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred;輔助T 細胞(Th)抗原表位的預測網(wǎng)站為http://www.imtech.res.in/raghava/propred;細胞毒性T 細胞(CTL)表位預測網(wǎng)站為http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred。

1.2.7 人血清中抗Mtb ClpP2 抗體水平測定 利用間接ELISA 法來檢測人對Mtb ClpP2 的B 細胞免疫反應，共檢測40 例結核病患者血清和40 例正常人血清。取純化的重組蛋白ClpP2 溶液(10 g/ml)100 μl，包被96 孔酶標板，4℃過夜，次日去掉包被液，用PBS(pH7.4)洗滌3 次;加入含2% BSA 的PBS 溶液300 μl，37℃封閉2 h，去掉封閉液，用含有0.05%Tween-20 的PBS 液(pH7.4)進行洗3 次;然后加入1∶100 稀釋M.tb 血清/健康人血清樣本，每孔100 μl，同時設有空白對照，37℃孵育2 h，去掉，0.05% Tween-20 的PBS 液(pH7.4)進行洗4 次，每次間隔3 分鐘，加入1∶2 000 HRP 羊抗人IgG，每孔100 μl，37℃孵育1 h;加入TMB 液37℃孵育15 min進行顯色;加入2 mol/L H2SO4終止反應，測定450 nm 處吸光度值。每個樣本重復測試三次。

2 結果

2.1 ClpP2 重組質粒鑒定 重組質粒pET32a(+)-ClpP2 進行KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，經(jīng)電泳顯示重組質粒雙酶切后見約5 900 bp 的大片段和約645bp的小片段，分別與pET32a(+)空質粒大小和ClpP2基因片段大小一致(見圖1)。初步鑒定重組質粒構建成功，將樣品pET32a(+)-ClpP2 質粒送至上海生工公司測序，雙向測序結果顯示測序結果與在Gen-Bank 中查找H37Rv 的ClpP2 基因序列完全一致(見圖1)。

2.2 rClpP2 的誘導表達、純化及SDS-PAGE 分析 含有Mtb ClpP2 基因的重組質粒pET32a(+)成功構建和然后轉入E.coli BL21(DE3)。經(jīng)過IPTG 在37℃條件下誘導2 h 后，ClpP2 重組蛋白從轉化細胞被成功表達。菌體裂解后分別取上清與沉淀經(jīng)SDS-PAGE 進行檢測(見圖2)，結果顯示重組蛋白主要在沉淀中表達(即不溶性表達)。經(jīng)IPTG 誘導的BL21-pET32a(+)表達產(chǎn)物約在20 kD 處可見Trx 硫氧還蛋白條帶。同樣用IPTG 誘導的BL21-pET32a(+)-ClpP2 表達產(chǎn)物約在37 kD 處可見一條較濃蛋白條帶，為ClpP2 與Trx-His 的融合蛋白，表明重組融合蛋白已成功表達。誘導產(chǎn)物和純化產(chǎn)物均在同一位置呈現(xiàn)明顯單一條帶，同預測的分子量大小相符(37 kD)。重組蛋白SDS-PAGE 電泳后用bandscan 軟件分析，重組蛋白rClpP2 的純度大于90%。

2.3 重組蛋白的Western blot 鑒定 將重組蛋白與鼠抗His 抗體反應做免疫印跡實驗。Western blot結果表明重組蛋白rClpP2 在預期位置(大約37 kD)，能被鼠抗His 抗體識別(圖3)。

圖1 ClpP2 重組質粒的雙酶切(上)及測序鑒定結果(下)Fig.1 Identification of vector of PET32a(+)-ClpP2 by double restriction enzyme digestion(Up)and nucleotide sequencing(Down)

2.4 Mtb ClpP2 蛋白抗原表位預測結果 采用ABCpred 方 案(窗 口 長 度 16，閾 值 0.6)進 行篩選［13］，并進行驗證和評分，結果表明ClpP2蛋白的第176～191，197～212 和45～60 位等19 區(qū)段可能存在優(yōu)勢B 細胞表位。將ClpP2 蛋白氨基酸序列提交CTL 表位預測網(wǎng)站，選擇基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡法［14］，預測出3 個分值比較高的多肽，分別為16～24 位的LPSFIEHSS、105～113 位的LGQAASAAA 以及22～30 位的HSSFGVKES。使用在線程序對ClpP2 蛋 白Th 表位進行的預測［15］，預測出DRB1_0101、DRB1_0102 和DRB1_0103 三種不同類型。這些預測結果表明Mtb ClpP2 蛋白具有誘導較強的細胞免疫和體液免疫應答的潛能。

圖2 SDS-PAGE 鑒定誘導ClpP2 蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

圖3 重組蛋白的Western blot 鑒定Fig.3 Western blot results of recombinant protein

2.5 重組ClpP2 蛋白免疫兔血清中抗體反應 用重組蛋白ClpP2 蛋白和弗氏佐劑對兔進行皮下多點免疫，誘導產(chǎn)生多克隆抗體。將多克隆抗體進行等比稀釋后作為間接ELISA 法中反應的一抗，同時設陰性和空白對照，測出OD450nm 值并進行分析，當(陽性值-空白值)/(陰性值-空白值)＞2.1 時所對應的最高多克隆抗體稀釋的倍數(shù)即為此抗體的效價，結果得出重組蛋白ClpP2 蛋白和弗氏佐劑免疫的兔血清的抗體效價為1∶64 000，而僅用弗氏佐劑免疫的兔血清中并無抗體反應(抗體效價低于1∶100)，說明純化的重組蛋白具有較強的免疫原性(見圖4)。同時我們用重組ClpP2 蛋白和Mtb H37Rv 中的菌體蛋白驗證兔抗血清的特異性，Western blot 結果顯示重組蛋白ClpP2 以及Mtb H37Rv中的菌體蛋白，分別在預期位置37kD 和21kD 處能被兔抗rClpP2 血清特異性識別(見圖5)。

圖4 Anti-ClpC2 抗血清效價的ELISA 測定Fig.4 Detection of anti-ClpC2 anti-sera titers by ELISA

圖5 兔抗rClpP2 血清與rClpP2 以及Mtb H37Rv 菌體蛋白的特異性反應Fig.5 Specific reaction of anti-rClpP2 rabbit serum with rClpP2 or Mtb H37Rv protein

圖6 人血清中anti-ClpP2 IgG 水平Fig.6 Sera anti-ClpP2 IgG levels

2.6 患者血清中抗Mtb ClpP2 抗體水平 為研究TB 病人對Mtb ClpP2 蛋白的免疫反應，用間接ELISA 法分析了人血清針對重組蛋白rClpP2 的IgG抗體水平。通過間接ELISA 法檢測40 例結核病患者和40 例正常人的血清中anti-ClpP2 抗體的水平，結果如圖6。TB 病人血清的anti-ClpP2 在OD450nm平均吸光度值(1.136 ±0.147)，明顯高于健康對照組(0.579 ±0.158，P＜0.001)。

3 討論

ClpP2 蛋白酶是結核分枝桿菌生長的必需基因，在復氧和應激狀態(tài)下對Clp 蛋白酶的底物特異性，向上調控具有重要作用［16，17］。復氧反應蛋白與Mtb 感染的再激活有關。Pai 等［18］認為它們可能有助于新的有效的診斷手段的開發(fā)。因此，像ClpP2這樣的復氧反應蛋白如果可以用于識別潛伏感染個體，那么他們就會得到預防性治療。重組質粒ClpP2-PET32a(+)在E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導后，目的蛋白以包涵體的形式表達，雖然經(jīng)過多次條件優(yōu)化，重組質粒ClpP2 蛋白仍然以包涵體的形式表達。純化蛋白經(jīng)過透析復性后SDS-PAGE 分析，重組蛋白為優(yōu)勢蛋白，純度為93%，適用于ELISA 方法評估其所介導的體液免疫反應。

近年來，生物信息學方法輔助和結合科研實驗方法逐漸成為研究蛋白結構、免疫原性的重要手段，這不僅減少了實驗工作量，也節(jié)約了時間和研究經(jīng)費。我們對Mtb ClpP2 的可塑性預測和抗原性指數(shù)分析表明，ClpP2 蛋白存在多個潛在的抗原表位;此外，利用網(wǎng)上在線軟件預測出3 個CTL 表位、3 個Th 表位及多個B 細胞表位。由此表明，ClpP2 蛋白不僅能被CD4+Th 細胞和CD8+細胞毒性T 細胞識別，還能被B 細胞識別，預示著該蛋白具有誘導細胞免疫、體液免疫應答的潛能。在此基礎上，本研究通過動物實驗對ClpP2 的免疫原性進行了研究，將rClpP2 蛋白皮下免疫兔子后能誘導較高水平的體液免疫應答。同時我們也驗證了Mtb ClpP2 蛋白在臨床結核病人血清中也展示較強和特異免疫學反應。

本研究通過純化蛋白成功制備兔抗ClpP2 多克隆抗體，制備的多克隆抗體可與H37Rv 中ClpP2 蛋白發(fā)生抗原抗體反應，從而證實制備的多克隆抗體具有良好的特異性;首次采用純化的ClpP2 蛋白檢測到肺結核病人中的血清學有anti-ClpP2 升高，說明純化的ClpP2 蛋白可作為結核病血清學診斷的混合抗原或抗體之一。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們進一步深入研究ClpP2 蛋白的生物功能，作為診斷靶標、藥靶候選蛋白的可行性及兔抗ClpP2 多克隆抗體生物學功能提供實驗基礎。

總之，這是第一次顯示ClpP2 具有對診斷活動性肺TB 的潛力。當然Mtb.ClpP2 蛋白被用作血清學測試診斷TB 方面的潛在用途需要進一步肯定。Mtb.ClpP2 蛋白也可能參與機體的免疫調節(jié)功能，但其所誘導的有關細胞免疫功能需要更多的實驗去驗證。

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